摘要
相信童鞋們在WB磷酸化蛋白時會碰到各種問題,WB磷酸化蛋白結果不理想而又不知道問題所在,導致覺得實驗難做,這時特別希望高手指點迷津。那做好WB磷酸化蛋白需要注意哪些事項?在此總結了多年經驗和技巧,讓各位科研民工們少走彎路。
- 關于/磷酸化蛋白樣品,裂解液問題
- 蛋白的磷酸化是一個非常迅速的反應,所以取樣品的過程要迅速,樣品要新鮮,樣品處理最好在冰上操作,操作時間盡量短。用PBS洗滌細胞時,PBS一定要4℃預冷。如果是組織的話,提取蛋白時采用液氮研磨的方法,研磨器具最好提前預冷,保持低溫的狀態。
- 提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鮮配制,裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,否則即使條帶壓出來也會很淺,結果也不可信。okadaic acid,NaF是磷酸酶抑制劑。再者,還要看你檢測的蛋白磷酸化位點是什么氨基酸,如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉,上樣前不要煮沸,煮沸可能會破壞其磷酸化位點。
- 提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存,最好是收集完成后馬上變性并于-80℃分裝保存,以保證降解程度最小。同時避免反復凍溶導致磷酸基團的降解。
- 關于/Western Blot操作問題
- 磷酸化蛋白的表達豐度較低,一般只有總蛋白量的10%,甚至更低,一定要確保每個凝膠孔中有足夠的目的蛋白上樣量。
- 磷酸化蛋白容易脫磷酸化,除提取蛋白時要迅速小心外,也可在上樣緩沖液和轉移緩沖液中加入磷酸化酶抑制劑Na3VO4等。
- 磷酸化抗體的好壞是一個關鍵因素,所以要選擇好的廠商。好抗體,傻瓜也能做出來,不好的抗體神仙也無辦法。有些公司的抗體很好,有些公司的抗體很差(一些大公司同樣會有低劣產品),而且這一點對非磷酸化的抗原檢測也很重要。
- 因為磷酸化蛋白只占總蛋白量的極少部分,加入一抗后最好4℃過夜,保證抗體有充分的結合時間。4℃也可以使一抗重復使用多次。畢竟磷酸化抗體都挺貴的。二抗則室溫1h即可。4℃過夜,主要原因不是使抗體結合更好,而是蛋白抗原不容易從膜上脫落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附屬熱力學范疇,高溫下容易脫落。而抗體-抗原結合是熱力學與動力學問題,高溫容易結合是熱力學范疇,抗體、抗原濃度卻是動力學范疇。膜上的抗原脫落了,結合效率會低。
- 磷酸化蛋白WB時,用洗滌液漂洗時也要注意一下,搖床的轉速不要太快,洗的時間不要太長,孵育一抗和二抗之后分別洗3次,每次5min即可。寧愿深一些,總比做不出來強得多。另外,洗的時候,最好不要把幾張膜疊在一起洗。
- 關于/磷酸化抗體的說明書
- 磷酸化抗體的說明書大家一定要仔細看,并最好根據廠商的操作說明來操作實驗,這是實驗成功的保證。因為不同的磷酸化抗體公司推薦的操作步驟不同。比如upstate的gamma-H2AX就需要脫脂奶粉封閉,一抗、二抗也需要脫脂奶粉配制;而CST的一些抗體則是脫脂奶粉封閉,一抗、二抗用BSA配制。其中原因不詳,但是應該是非常關鍵的,我試過用BSA配gamma-H2AX,背景很高,目的條帶非常淡。
- 關于/WB時背景和條帶的問題
- 磷酸化蛋白WB時背景也往往較深,所以壓片時間要適當,不能太長或過短,太長則背景太深蓋住想要的那條帶,時間過短則可能沒有條帶或者條帶太淺。
- 洗滌液對最后的背景影響也較大,密理博(millipore)最近的說明書推薦用雙蒸水洗滌,我對比了TBST洗滌的膜,效果有一定差距,背景有效降低,即便壓片30min,背景仍然是可以忽略的。我想,雙蒸水充分減少了ECL反映中其他緩沖液的影響,應該是可取的。
- 做磷酸化蛋白WB時,除了目標蛋白的條帶以外,往往會出現非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話,甚至會壓出非特異性的條帶,反而沒有你想要的條帶,所以壓片后,一定要根據Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。
- 關于/蛋白總的表達量問題
- 研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法,一是:相同的樣品在不同的孔中上樣兩次(可在相同的膠上,也可在不同的膠上),其一壓磷酸化蛋白,另一壓該蛋白總的表達量(包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白),甚至還可跑另一個膠,壓內標。但是一般不建議如此做,因為這樣比較時誤差還是較大的。因此,比較公認的,也是常用的方法,即用strip液將原先結合上的磷酸化抗體及二抗洗去,然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次,再壓內標。
- 關于/Strip時的問題
- Strip時一定要注意,膜一定要完全泡在strip solution中(可用較硬的塑料膜封好),然后要完全浸入水中,使受熱均勻。這一點很重要,要不然,隨后壓出來的總蛋白也好,內標也好就會不均一,無法進行比較。
- strip液是用來去除已結合的抗體,但也會去除部分的蛋白,導致蛋白信號變弱。實驗發現水浴有時溫度不穩定,溫度定為55℃時往往其溫度容易超過,導致較多的蛋白也被去除,故建議溫度設為50℃,30min,既能有效去除已結合的抗體,又比55℃更能保護蛋白。
- Tips:以上就是磷酸化蛋白WB的注意事項,更多磷酸化蛋白WB相關的詳細內容會不定時的更新,歡迎微信關注:bio-review。并推薦閱讀:Western blot 條帶分析