生物評論周報第134期:Science Advances:PCR技術測量端粒長度

 

1、Science Advances新型數字PCR技術可在3小時內測定“端粒”單分子絕對長度

 

2020年8月21日,來自新加坡國立大學的研究人員在《Science Advances》雜志上發表了題為“Massively parallel single-molecule telomere length measurement with digital real-time PCR”的研究結果,他們設計了一種名為單端粒絕對長度快速分析(STAR)的新方法,能夠快速測量端粒的絕對長度。他們報告稱,該方法準確靈敏,并且能夠測定癌細胞中的染色體外端粒重復序列(ECTR)。

 

此次開發的STAR方法是利用數字PCR技術對樣本進行分液,然后在納升級區室內測定端粒重復序列的長度。在此過程中,他們采用Fluidigm的48.770數字芯片和Biomark HD系統(48.770代表可運行48個樣本,每個樣本分成770小份進行數字PCR分析)。

 

PCR擴增導致PCR產物的增加與端粒重復片段的初始長度或拷貝數成正比。PCR產物的增加體現在熒光強度的變化中。通過對熒光信號的實時監測,研究人員可捕獲產物變化。

 

此外,他們還用EvaGreen染料來取代經典的SYBR Green I染料,并對退火溫度和引物濃度進行了調整。同時,為了測定端粒的絕對長度,他們利用已知長度的合成端粒生成了標準曲線,并根據該標準曲線來計算其他端粒的長度。

 

新型數字PCR技術

Fig 1.?STAR assay allows single molecule telomere length measurement

 

研究人員利用一組癌細胞驗證了STAR分析,并與TRF和其他方法的結果進行了對比。他們報告稱,通過STAR分析測得的端粒平均長度與金標準的TRF方法高度相關,這表明STAR分析是測量端粒絕對長度的可靠方法。而且,處理時間減少了三個小時。

 

之后,他們又利用STAR分析來定量染色體外端粒重復序列,這是癌細胞的一種特征,它利用同源重組機制來維持其端粒。他們對四個兒科的成神經細胞瘤樣本進行了分析,發現兩個樣本呈陽性,兩個樣本呈陰性,與其他研究的結果一致。這表明腫瘤實驗室可采用STAR分析來確定端粒的維持機制。

 

(評論:哇塞~?3小時內測量多達48個樣品的單個端粒的絕對端粒長度,這效率和準確度真的可以幫助到端粒長度異常與許多衰老相關疾病預防和治療。

 

文章來源:

Yongqiang Luo,Ramya Viswanathan et al.Massively parallel single-molecule telomere length measurement with digital real-time PCR. DOI: 10.1126/sciadv.abb7944

 

2、Nature Immunology:PD-1阻斷療法的臨床療效可被預測

 

2020年8月31日,來自日本名古屋大學醫學研究科免疫學系Hiroyoshi Nishikawa研究組在《自然-免疫學》雜志上發表了題為“The PD-1 expression balance between effector and regulatory T cells predicts the clinical efficacy of PD-1 blockade therapies.”研究成果。他們的研究認為效應性和調節性T(Treg)T細胞之間的程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)表達平衡可預測PD-1阻斷療法的臨床療效。

 

PD-1阻斷療法

Fig?2.?Responders to PD-1 blockade therapies have high PD-1+CD8+ Tcell infiltration in the TME

 

他們顯示腫瘤微環境中PD-1 + CD8 + T細胞相對于PD-1 + Treg細胞的頻率可以預測PD-1阻斷的臨床療效,并且優于其他預測因子,包括PD配體1(PD-L1)表達或腫瘤突變負荷。CD8 + T細胞和Treg細胞的PD-1表達分別對效應性和免疫抑制功能產生進行負向調控。PD-1阻滯既可導致功能障礙的PD-1 + CD8 + T細胞恢復,又可增強PD-1 + Treg細胞介導的免疫抑制作用。

 

通過阻斷PD-1,效應性PD-1 + CD8 + T細胞而不是PD-1 + Treg細胞的徹底重新激活對于腫瘤消除是必要的。這些發現為PD-1阻斷療法提供了有望的預測性生物標志物。

 

(評論:據了解,免疫檢查點封鎖已在癌癥治療中提供了范式轉變,但是這種方法的成功因素是非??勺兊?。因此,迫切需要可預測臨床療效的生物標志物。)

 

文章來源:

Shogo Kumagai, Yosuke Togashi?et?al,?The PD-1 expression balance between effector and regulatory T cells predicts the clinical efficacy of PD-1 blockade therapies.?DOI: 10.1038/s41590-020-0769-3.?Nature Immunology:最新IF:23.53

 

3、Science:中國科學家發現谷氨酸能神經元對睡眠穩態調節的重要作用

 

2020年9月4日,來自北京大學麥戈文腦科學研究所李毓龍研究組合在《Science》雜志發表了題為“Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons.”的研究論文,該項研究利用新型遺傳編碼的腺苷探針,發現基底前腦區的谷氨酸能神經元對于睡眠壓力的積累起著重要的調控作用,進一步揭示了睡眠穩態調控的神經環路機制。

 

谷氨酸能神經元對睡眠穩態調節

Fig?3 ,腺苷快速釋放和睡眠穩態的神經調控。

 

目前,主流理論認為“腺苷”參與到睡眠穩態調節過程中,其在清醒狀態下的積累導致了“困意”的產生,而咖啡的主要成分咖啡因可以通過阻斷腺苷與其受體的結合而達到促進清醒的效果。基底前腦被認為是腺苷參與睡眠穩態調控的重要腦區,環路層面的研究表明,該區域的局部神經環路參與到對睡眠覺醒的調控中,然而神經元活動調控腺苷釋放的機制目前還不清楚。這限制了人們對睡眠覺醒調控機制的深入解析。

 

為了實現在睡眠覺醒周期中對基底前腦區胞外腺苷濃度高時空分辨率的檢測,李毓龍研究組開發了一種新型的遺傳編碼的腺苷探針,該探針可以將胞外腺苷濃度的變化轉化為探針熒光強度的快速變化。

 

利用該腺苷探針,徐敏研究組發現基底前腦區的腺苷濃度在清醒狀態時較高,在非快速眼動睡眠時較低,這與之前采用微透析法測量腺苷濃度變化的研究結果相一致。然而,小鼠的快速眼動睡眠時長較短,傳統的微透析方法無法對快速眼動睡眠時期的腺苷濃度進行精確測量。得益于該探針的高時間分辨率,徐敏研究組首次發現,腺苷在快速眼動睡眠時期也存在很高的濃度,并且高于清醒和非快速眼動睡眠狀態。不僅如此,研究者觀察到,腺苷濃度在睡眠時相轉變時存在快速的變化,提示其與神經元的活動密切相關。

 

為了進一步探究腺苷濃度增加與神經元活動的關系,徐敏研究組探究了基底前腦區兩類神經元:乙酰膽堿能神經元和谷氨酸能神經元與腺苷濃度變化的相關性和因果性。結果表明這兩類神經元的鈣活動與胞外腺苷濃度高度相關,并且神經活動總是提前于腺苷釋放。光遺傳激活這兩類神經元能引起胞外腺苷濃度不同程度的增加,而谷氨酸能神經元的激活是腺苷濃度增加的主要原因。進一步,研究人員特異性損毀基底前腦區的谷氨酸能神經元,結果表明,胞外腺苷濃度的增加顯著低于對照組小鼠。以上試驗表明,谷氨酸能神經元的活動參與調控胞外腺苷積累過程。

 

(評論:這為為探索睡眠障礙的治療方法提供了重要參考。)

 

文章來源:

Wanling Peng,Zhaofa Wu et al.?Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons.?DOI: 10.1126/science.abb0556?Science:最新IF:41.037

 

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