脫鹽換液，就用Sephadex G25

Sephadex G25 是以葡聚糖為基質的凝膠過濾層析介質，其工作原理主要是利用具有網狀結構的葡聚糖凝膠分子篩作用，根據被分離物質不同分子大小進行分離篩選。層析時，大于凝膠孔徑的大分子，被阻于凝膠相外，沿著凝膠顆粒之間的間隙走，下移速度最快，故最先洗脫下來，中分子物質部份進入凝膠內部，洗脫速度為其次，而小分子物質因全部進入凝膠，受到阻力最大，故最后被洗脫下來。Sephadex G25葡聚糖層析介質分離范圍為1～5kD(球形蛋白)，主要用于多肽的分離以及大分子蛋白質的脫鹽和緩沖液替換。

脫鹽介質&脫鹽柱

備注：按凝膠介質粒徑不同，Sephadex G25系列介質可分為四類，分別為：Sephadex G25粗， Sephadex G25中等，Sephadex G25細和 Sephadex G25超細，上表的Sephadex G25屬于Sephadex G25（M）中等。

產品特性

層析色譜圖如下：

應用實例

色譜柱：XK16/30脫鹽柱，柱床高度25 cm。

平衡緩沖液：20 mM PB+150 mM NaCl pH 7.0，0.45 μm濾膜過濾。

流速：2 mL/min。

柱平衡：將色譜柱連接至純化儀器，使用平衡緩沖液沖洗脫鹽柱 2-3 倍柱體積（Column Volume，以下簡稱 CV）。

加載樣品：某蛋白樣品，上樣體積為1 mL。為盡可能增加層析柱的使用壽命，樣品上樣前須進行澄清處理，如 10000 g 離心10min 或0.45um 濾膜過濾。

洗脫：使用平衡緩沖液沖洗脫鹽柱 2 CV 以上，使用流速不要超過推薦的最大流速。

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使用方法

Sephadex G25 系列介質常用于蛋白溶液的脫鹽、緩沖液交換和不同分子量蛋白的分離等。

根據不同的用途其上樣量也不盡相同，進行緩沖液置換或脫鹽時最高可上樣 20%柱體積。

1、 介質溶脹

以干態供應的 Sephadex G25 系列介質，使用前必須在過量的溶液中充分溶脹，如 10 g 介質溶脹時加入 100-150 mL 水，溶脹 3 h 以上。沸水浴可加速溶脹速度（如 90℃ 1 h 即可），但要避免劇烈攪拌，以防凝膠破碎。

2、 層析柱填裝膠懸液的準備：

計算所需溶脹介質的量（柱床體積為 1 L 時所需 100%沉降膠約為 1.15 kg）。（例如：裝填 16/20 柱，柱床高度 10 cm，所需溶脹介質的量為 π×(1.6/2)2×10×1.15=23.11 g 稱取 23.11g介質于干凈燒杯中，加入一定量（如 12 mL）的裝柱溶液，攪拌使其形成均勻的膠懸液。）

裝柱：

1）檢查層析柱，確保各部件完整、干凈。安裝下柱頭，擰緊 O 型圈后，將層析柱垂直固

定在鐵架臺上，用水平儀檢查并調整，使層析柱保持水平。

2）層析柱中加入適量的裝柱溶液，以除去柱子中的空氣。擰上底部的堵頭，柱內保留 1-2

cm高度的裝柱溶液。

3）用玻璃棒緊靠柱內壁引流，將膠懸液連續倒入層析柱中，以減少氣泡的產生。介質自然沉降至體積不再變化，此時介質和溶液出現分層，上層溶液完全澄清。

4）連接上柱頭至低壓層析系統，開泵以一定流速排出管路中殘留的空氣，暫停系統，將上柱頭安裝至層析柱上，柱頭下端距離膠面約 1 cm，擰緊 O 型圈，開泵以 300-500 cm/h 流速壓柱至柱床體積不再變化，繼續壓柱 5-10 min，用記號筆標定膠面所在位置。

5）暫停系統，擰上底部的堵頭，使層析柱上端和泵斷開，向下轉動調節桿，至記號處以

下 0-0.5 cm 停止，擰上上端堵頭。裝柱完成。

3、 清洗及再生

在位清洗：為除去變性蛋白、脂蛋白或脂質，需要對介質進行在位清洗。常用的清洗液為0.2 M NaOH 或非離子型去垢劑，清洗 2-3 CV。

4、 保存條件

20%乙醇或 0.01 M NaOH，室溫保存。

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