《Science》:“魔剪”的新突破

感染病毒的人通常攜帶非常少量的循環病毒顆粒,使得感染難以檢測。例如,在涉及寨卡病毒的一次暴發期間,感染的個體每微升血清含有少至一個病毒拷貝。這些小數字對于醫學診斷來說是一個很大的問題。然而,研究人員未來可能會使用分子工具,這些分子工具的靈敏度已經過進化的改進。在《Science》雜志上發表的一系列文章中,報告了一種新的診斷工具,它是由在細菌中發現的核酸檢測系統所創造的。

 

CRISPR-Cas系統是適應性免疫系統,通過作為核酸傳感器的功能保護細菌免受病毒攻擊。先前侵入細菌的病毒的核酸序列被存儲在細胞基因組中,并且被Cas酶用作指導,如果病毒再次入侵,其用于識別和結合相同的序列。然后通過序列特異性相互作用切割進入的病毒核酸。

 

CRISPR-Cas系統

 

一種來源于細菌化膿鏈球菌的特定CRISPR系統已被改造用作革新生物醫學研究的基因組編輯工具。但是,還有很多其他類型的CRISPR系統,每個系統都有其特定的特征。目前的三項研究使用具有不尋常特性的CRISPR系統:在接合目標核酸后,它們不加區分地切割其他附近的核酸,這一過程稱為側支活性。這些研究使用這種活性作為信號放大器,由此許多任意核酸的切割作為檢測一種特定分子的信標。

 

美國加州大學伯克利分校分子與細胞生物學系Janice S. Chen等人研究了一種使用Cas12a蛋白來定位病毒DNA的V型CRISPR系統。發現Cas12a具有側支活性,在與其特異性雙鏈DNA靶標結合后不加選擇地切割單鏈DNA。研究人員利用這一特性創建了一種檢測病毒的診斷工具。

 

CRISPR系統切割單鏈DNA

 

在作者的診斷中,Cas12a指導序列的設計是為了匹配病毒DNA中的特定目標。在與病毒靶標結合后,Cas12a切割“reporter”,這個“reporter”是一端用熒光基團分子標記且另一端用猝滅劑分子標記的單鏈DNA。在切割之前,熒光團發射的熒光被猝滅劑捕獲。然而,在單鏈DNA被Cas12a切割之后,可以容易地檢測到熒光。使用一種叫做重組酶聚合酶擴增(RPA)的過程來增強這種熒光信號,以擴增目標病毒DNA,產生比原始樣品中更多的靶序列拷貝。

 

Cas12a切割“reporter”

 

研究小組開發了一種名為DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR?trans?reporter)的病毒傳感器,它有三部分:Cas12a酶;一種RNA序列,目的是引導Cas12a對一種感興趣的病毒進行匹配的DNA序列;和一個單鏈DNA結構標記有熒光團和猝滅分子。在沒有目標病毒序列的情況下,Cas12a是不活躍的,熒光團產生的發射光被猝滅劑捕獲,阻止熒光。當Cas12a識別其目標時,它會裂解單鏈DNA結構,將猝滅劑與熒光團分離,產生熒光。DETECTR系統能夠檢測極低的濃度的目標DNA ,甚至每微升樣品中低至一個分子。DETECTR可以從患者樣本的粗DNA提取物中辨別不同的人乳頭瘤病毒株。

 

麻省理工學院的Jonathan S. Gootenberg創建了一種名為SHERLOCKv2(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking version 2)的診斷方法。 SHERLOCK的原始版本與DETECTR的原理類似,但使用Cas13,能結合并不加區分地切割RNA,而不是DNA。然而,SHERLOCK并不限于RNA檢測,在RPA過程中可以包括轉錄步驟以從病毒DNA產生RNA,從而通過間接進行DNA檢測。Gootenberg和同事在幾個方面改進了SHERLOCK。首先,他們篩選了17位Cas13家族成員,并充分表征了他們的活動。發現Cas13變體的一個子集靶向相互排斥的序列。通過使用四種這樣的Cas13蛋白質并為每種蛋白質設計特定的報道基因,創建了SHERLOCKv2系統,該系統一次可以檢測多達四種病毒。此外,通過擴大RPA步驟,該組檢測到濃度低至每毫升樣本兩拷貝的病毒DNA序列。

 

SHERLOCKv2系統

 

研究人員還發現,Cas13切割產物可激活另一種Cas蛋白Csm6。第二個單鏈RNA結構可以通過激活的Csm6來切割,增強了相對于背景的信號并且改善了SHERLOCKv2反應的動力學。最后,將所有這些進展結合到一個簡單的測定中,將一滴樣品滴加到診斷試紙上,并給出比色讀數。這種方式不需要儀器,大大增加了科學家和臨床醫生在高需求地區使用該技術的簡易程度。

 

Cas蛋白Csm6

 

兩種細菌Cas蛋白在與特定靶序列結合后不加選擇地裂解核酸?,F在,該屬性已被用于創建高度敏感的便攜式診斷工具,以低成本檢測病毒。以上兩種開發的技術都需要嚴格的純化步驟來防止病毒在測試過程中被身體的RNA酶降解。麻省理工學院Cameron Myhrvold等人將先前報道的SHERLOCK版本與一種使體液中的這些酶失活的方法配對,使其能夠直接檢測尿液和唾液中的病毒。他們的方法可以用來區分相關的病毒種類,由于這些病毒會導致類似的癥狀,因此很難區分。

 

病毒基因組可以快速變異,但是Myhrvold及其同事表示,他們可以使用他們的系統來區分不同于單個核苷酸突變的序列。這使他們能夠鑒別從不同地理區域分離出來的寨卡病毒的菌株,以及攜帶與稱為小頭畸形的發育狀況相關的突變的寨卡病毒。他們表明,可以在不到一周的時間內設計合適的指導序列,并且整個方案在不到兩個小時內完成,設備和樣本處理最少。

 

當前描述的診斷工具是追蹤和治療病毒爆發的重大進展。但除病毒檢測之外,它們也可以有多種應用,例如鑒定個性化藥物的腫瘤特異性癌癥突變,以及通過檢測可能的生物污染物來提高農業和生物制造的質量控制。雖然他們的長期保質期仍有待測試,但這些工具優于世界衛生組織制定的其他ASSURED標準中的即時診斷設備,并且已準備好部署。這些技術的影響和采用將取決于監管批準,大規模生產綜合,配送物流和經濟等因素。

 

CRISPR技術的許多令人興奮之處在于它在基因或細胞療法上的應用,這是昂貴的過程,在可預見的未來,可能只在世界繁榮的地區才能使用。目前的研究通過開發具有許多重要潛在用途的低成本技術,極大地擴大和豐富了CRISPR技術的可能受益者。

 

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