PCR疑難問題粉碎機(二)——熒光定量PCR

 

 

【前情回顧】PCR疑難問題粉碎機(一)——終點PCR

 

實時熒光定量PCR(quantitative?PCR, qPCR)通過對PCR擴增反應中的每一個循環產物熒光信號的實時監測從而實現對起始模板的定性及定量分析。目前它主要通過兩種方式——熒光染料或者熒光標記的探針對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,并結合相應的軟件對產物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度。

 

熒光定量PCR,qPCR

 

熒光染料法

 

在PCR反應體系中,加入過量熒光染料,該染料只與雙鏈DNA小溝結合,并不與單鏈DNA鏈結合,而且在游離狀態不發出熒光,只有摻入DNA雙鏈中才可以發光,因此,在PCR體系中,隨著特異性PCR產物的指數擴增,每個循環的延伸階段,染料摻入雙鏈DNA中,其熒光信號強度與PCR產物的數量呈正相關。

 

武漢艾美捷科技專注為客戶提供整體打包方案,可提供EvaGreen、SolisGreen和SYBR等多種染料qPCR預混液。

 

熒光染料法

 

EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料

熒光染料包括飽和熒光染料非飽和熒光染料,非飽和熒光染料的典型代表就是現在最常用的SYBR GreenⅠ,EvaGreen、SolisGreen屬于飽和熒光染料。非飽和熒光染料在濃度高的時候會對PCR過程產生抑制,所以在熒光定量實驗時使用濃度稍低,染料不能占據DNA雙鏈上的所有位置。當PCR隨著溫度上升,雙鏈逐漸解鏈,染料會從已解開的單鏈上脫落,然后結合到臨近的尚未解鏈的雙鏈中去繼續發熒光。這種染料重排導致在較小的溫度變化內,雖然DNA雙鏈的解鏈過程不同,但熒光值是幾乎不變的,也就是說,其溶解曲線不能精確反應雙鏈的解鏈情況。

 

所以,對于非飽和染料,其溶解曲線分辨率相對較低,只能區分特異性的產物,不能分辨單堿基的差異。飽和熒光染料在DNA雙鏈中所有可結合位點內都會有染料分子存在,染料與DNA的結合呈飽和狀態,隨著溫度上升,在雙鏈解鏈、染料脫離過程中,未解鏈的雙鏈部分不存在染料可以結合的位點,染料不能發生重排。所以使用飽和染料制作的溶解曲線分辨率很高,可以精確反映DNA雙鏈隨著溫度的解鏈情況,精度可以達到單堿差異的區分。

 

熒光標記的探針法

 

PCR擴增時,加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸,兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團, 探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收,PCR 儀檢測不到熒光信號; PCR擴增時(在延伸階段),Taq 酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條 DNA 鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步,這也是定量的基礎所在。

 

熒光標記的探針法

 

染料法VS探針法

1.探針法通過探針可以增加反應收集信號的特異性,只有探針結合的片段上發生擴增才能收集到信號,探針法能夠用多重體系反應,能夠預測和提前進行反應條件的優化,缺點是要合成探針,成本高

2.染料法經濟實惠,可以做溶解曲線,分析全部PCR產物的TM值,缺點就是特異性沒有探針法好

 

熒光定量PCR

 

類型 貨號 名稱
染料法 EvaGreen染料 08-36-00001 5×HOT FIREPol? EvaGreen? qPCR Supermix 5×qPCR 預混液
08-24-00001 5×HOT FIREPol? EvaGreen? qPCR Mix Plus (ROX) 5×qPCR預混液,ROX
08-25-00001 5×HOT FIREPol? EvaGreen? qPCR Mix Plus (no ROX) 5×qPCR預混液,無ROX
08-26-00001 5×HOT FIREPol? EvaGreen? qPCR Mix Plus (Capillary) 5×qPCR預混液,Capillary
SolisGreen染料 28-41-00001 SolisFAST™ SolisGreen? qPCR Mix (no ROX) ?5×qPCR預混液,ROX
28-46-00001 SolisFAST™ SolisGreen? qPCR Mix (ROX) 5×qPCR預混液,無ROX
SYBR染料 QP031 qPCR預混液2.0,ROX
QP041 qPCR預混液2.0,無ROX
探針法 08-17-00001 5×HOT FIREPol ? Probe Universal qPCR Mix
QP036 5×探針qPCR預混液,ROX
QP046 5×探針qPCR預混液,無ROX
08-16-00001 5×HOT FIREPol? Probe qPCR Mix Plus (Capillary)
 

多重qPCR

08-01-00001 5x HOT FIREPol? Multiplex qPCR Mix 5x多重探針qPCR預混液
08-02-00001 5x HOT FIREPol? Multiplex qPCR Mix (Rox) 5x多重探針qPCR預混液,Rox
08-03-00001 5x HOT FIREPol? Multiplex qPCR Mix (Purple) 5x多重探針qPCR 預混液,Purple
 

 

 

快速qPCR

28-21-00001 SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (no ROX) 快速探針qPCR預混液,含UNG,無ROX
28-22-00001 SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (ROX) 快速探針qPCR預混液,含UNG,ROX
28-23-00001 SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (Purple) 快速探針qPCR預混液,含UNG,Purple
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qPCR系統知識匯總

 

  1. 在qPCR 技術中重要的參數指標有哪些?

 

擴增及溶解曲線擴增曲線是PCR過程中,以循環數為橫坐標,以熒光強度為縱坐標所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態進程;溶解曲線是用來驗證擴增產物特異性的,如果產物是單一條帶,溶解曲線就會出現單峰,如果有引物二聚體或其它非特異性擴增,就會出現至少兩個峰。

 

熒光域值(threshold): 是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值,它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上,但一般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個循環熒光信號標準偏差的10倍,即:threshold。

 

Ct 值:是指每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數。將已知濃度的標準品梯度稀釋進行qPCR,按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。Ct值與起始模板數的對數值之間存在線性關系,可以制作標準曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值,代入標準曲線,就可以求出未知樣品的起始模板量。

 

擴增及溶解曲線

 

  1. 擴增曲線一般分為哪幾個階段

 

熒光擴增曲線一般分為基線期、指數增長期和平臺期。在qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化,此時即為基線期,

 

PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數形式增加的,隨著反應循環數的增加,最終PCR反應不再以指數形式生成模板,從而進入平臺期,在該時期,擴增產物已不再呈指數級的增加,PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系,只有在熒光信號的指數增長期,PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系,可以選擇在這個階段進行定量分析。

 

熒光擴增曲線

 

  1. ROX染料是什么作用?

 

ROX(Passive Reference Dye)是一種惰性參比染料,在qPCR反應中能被qPCR儀檢測到。ROX不參與qPCR反應,熒光信號值不會隨著qPCR擴增而改變。實驗過程中很多因素會引起孔間差異:不均勻的照明,孔與孔之間光學因素(液滴、氣泡)的因素,反應體系的濃度不同……?可以用ROX作為陽性參比,對其他熒光信號進行歸一化校正,以提高數據的精確度。

 

  1. Ct值多少才算理想

 

一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結果是可靠的,30以上基本可以說明該基因沒有擴增,但也不是絕對的,需要輔以溶解曲線加以解釋。

 

*** qPCR 常見問題分析?***

 

問題類型 原因分析
無Ct值出現 * 檢測熒光信號的步驟有誤:一般染料法采用72℃延伸時采集,探針法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號;
* 引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性;
* 模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;
* 模板降解:避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況
Ct 值出現過晚(Ct>38) * 擴增效率低:反應條件不夠優化,設計更好的引物或探針、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等;
* PCR各種反應成分的降解或加樣量不足;
* PCR產物太長:一般采用80-150bp的產物長度
標準曲線線性關系不佳 * 加樣存在誤差:使得標準品不呈梯度;
* 標準品出現降解:應避免標準品反復凍融,或重新制備并稀釋標準品
* 引物或探針不佳:重新設計更好的引物和探針;
* 模板中存在抑制物,或模板濃度過高
擴增曲線異常,比如 S 型曲線 * 參比染料設定不正確:預混液不加參比染料時,選NONE;
* 模板的濃度太高或者降解;
* 熒光染料的降解
負對照有信號、溶解曲線不止一個主峰 * 引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和發夾結構的出現
* 引物濃度不佳:適當降低引物的濃度,并注意上下游引物的濃度配比
* 鎂離子濃度過高:適當降低鎂離子濃度,或選擇更合適的mix 試劑盒;
擴增效率低 * 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解;
* 反應條件不夠優化:可適當降低退火溫度;
* 反應體系中有PCR反應抑制物:一般是加入模板時所引入,應先把模板適度稀釋,再加入反應體系中,減少抑制物的影響

 

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