BPS Bioscience,PARPtrap™試劑盒解決方案附文獻

PARP是一種在DNA修復、轉錄、凋亡和免疫功能中發揮關鍵作用的酶。PARP-1招募合成DNA酶來激活DNA修復。PARP-2維持基因組穩定性并修復DNA單鏈斷裂(SSB。PARP-1和PARP-2在DNA修復系統中具有相同的調節機制,但它們與DNA斷裂結合的機制不同。PARP抑制劑與PARP酶結合后,PARP蛋白會與DNA損傷位點結合形成PARP-DNA復合物而無法分離,這就造成了其他DNA修復蛋白無法參與修復過程,甚至會造成進一步形成DNA的雙鏈損傷,這就是制劑所造成的PARP Trap效應。由于PARP Trap對腫瘤細胞的具有更強的殺傷效應,因此,對抑制劑的PARP Trap能力檢測變的非常重要。

 

 

迄今為止,四種PARP抑制劑(olaparib、rucaparib、niraparib和talazoparib)已獲得FDA批準用于各種適應癥,如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌患者。PARP抑制劑對PARP家族成員和PARP-DNA捕獲效力表現出不同的抑制作用。這些特性與獨特的安全性/有效性特征相關。

近期,國際團隊在Molecular Cancer Therapeutics(AACR)在線發表了題為"Venadaparib Is a Novel and Selective PARP Inhibitor with Improved Physicochemical Properties, Efficacy, and Safety"的文章,合成了新型強效PARP抑制劑維那達帕利(Venadaparib,也稱為IDX-1197或NOV140101),評估了Venadaparib對PARP酶、PAR形成和PARP捕獲活性的療效,以及對BRCA突變細胞株的生長抑制作用,還建立了體外和體內模型,以研究藥代動力學/藥效學、療效和毒性。Venadaparib將有望成為下一代PARP抑制劑。Venadaparib的療效和安全性的Ib/IIa期研究已經啟動。

 

艾美捷科技作為BPS Bioscience中國區代理,非常榮幸能夠作為供應商為該項研究提供高品質PARPtrap™ Assay Kit for PARP1(80584),為生物醫學領域的科研探索貢獻一份力量。

 

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BPS Bioscience獨特的PARPtrapTM檢測試劑盒,非常適用于藥物研發和高通量篩選應用中,篩選增強PARP/DNA固定能力的小分子化合物。

貨號 名稱 規格 說明
80584-1 PARPtrap™ Assay Kit for PARP1 96rxns. 篩選增強PARP1/DNA固定能力的小分子化合物,并用于確定化合物的IC50值。
80584-2 384rxns.
78296-1 PARPtrap™ Assay Kit for PARP2 96rxns. 篩選增強PARP2/DNA固定能力的小分子化合物,并用于確定化合物的IC50值。
78296-2 384rxns.
78317 PARPtrap™ Combo Assay Kit for PARP1 and PARP2 384rxns 篩選增強PARP1/2在DNA上的固定能力的小分子化合物,并用于確定化合物的IC50值。

* 以上產品,均為熒光偏振測定法(fluorescence polarization, FP)

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引用產品:

該項研究中使用了艾美捷科技代理的BPS Bioscience的PARPtrap™ Assay Kit for PARP1(80584),用于檢測PARP1捕獲檢測。

 

【實驗技術,延伸解讀】

① PARP trapping assay,PARP捕獲檢測試驗

Venadaparib對重組人PARP-1酶的DNA結合活性的影響是通過BPS Bioscience進行的體外酶活性測定來確定的。PARPtrap酶活性測定試劑盒(目錄號80584;BPS Bioscience)用于該測定。Venadaparib、olaparib、rucaparib、niraparib、talazoparib和veliparib在濃度范圍為0.000026至5μmol/L進行了檢測。根據制造商的說明進行酶反應后,使用激發波長為485nm和發射波長為528nm的M1000微孔板閱讀器(Tecan Infinite)測量了熒光信號。

 

② Enzymatic assay against recombinant PARP enzymes,重組PARP酶的酶學檢測

venadaparib對重組人PARP酶(PARP-1、PARP-2、PARP-3、TNKS-1、TNKS-2、PARP-6、PARP-7、PARP-8、PARP-10、PARP-11、PARP-12、PARP-14和PARP-15,均采購自BPS Bioscience)進行了體外酶活性分析。Venadaparib在濃度范圍為0.000005至10μmol/L進行檢測。采用Synergy 2微孔板讀數儀(BioTek Instruments)測量了發光輸出。使用Prism 9(GraphPad Software)確定了IC50。

 

【產品解讀】

PARPtrap™ Assay Kit for PARP1(80584)

PARPtrap™ Assay Kit for PARP1旨在利用熒光偏振(FP)高通量篩選測定法測量PARP1/DNA復合物形成。PARP1以其DNA結合結構域而聞名。與DNA的結合激活PARP1,在NAD+存在的情況下,PARP1會對自身進行核糖基化(自動核糖基化),這導致核糖聚合物的負電荷積累,從而導致PARP1從DNA上解離。然而,在一些抑制劑的存在下,PARP仍然與DNA結合,這種現象稱為困擾。已經證明,被困的PARP-DNA復合物對癌細胞具有高度毒性,因此這類抑制劑對癌癥治療可能是可取的。

 

 

PARPtrap™ Assay Kit for PARP1的關鍵是熒光標記的寡核苷酸雙鏈。在未發生核糖基化的情況下,PARP1與熒光探針結合,形成大的復合物,并導致高度偏振光的發射。然而,在自動核糖基化后,PARP1從寡核苷酸雙鏈解離,然后自由旋轉,發射較少偏振光。添加PARP1抑制劑會導致PARP1被困在熒光寡核苷酸雙鏈中,并以劑量依賴的方式增加FP信號。

 

PARPtrap™ Assay Kit for PARP1是一種熒光偏振均相分析法。FP信號是使用能夠測量熒光偏振的熒光微孔板讀數器來測量的。

 

產品組分:(96次規格,為例)

貨號 名稱 規格 保存條件
80501 PARP1, GST-tag* 1 μg -80°C
78273 Fluorescent labeled oligonucleotide duplex (25 nM) 100 μl -80°C
5x PARPtrap™ assay buffer 2 x 1 ml -80°C
10x NAD+ 500 μl -80°C
79685 Black 96-well plate 1 Room Temp

 

實驗步驟(簡易漢化,請務必以英文原版說明書為準):

  • 所有樣本和對照應進行重復操作。
  • 實驗應包括一個“空白”、一個“參考”,一個“低FP對照”和一個“高FP對照”。
  1. 準備Master Mix(每孔20 μl):N孔 x(6 μl 5倍PARPtrap™測定緩沖液 + 1 μl 25 nM熒光標記的DNA + 13 μl蒸餾水)。例如,對于20個孔,準備:120 μl 5倍PARPtrap™測定緩沖液 + 20 μl 25 nM熒光標記的DNA + 260 μl蒸餾水。
  2. 通過將1份5倍PARPtrapTM測定緩沖液稀釋為4份蒸餾水,制備1倍PARPtrapTM測定緩沖液。只稀釋所需的試劑量。
  3. 準備抑制劑溶液。
    如果抑制劑化合物溶解在DMSO中,將其在水中稀釋10倍,使得所有樣本中DMSO的最終濃度為1%。如果化合物溶解在除DMSO以外的稀釋劑中,請使用該稀釋劑制備對照稀釋劑溶液。
  4. 準備酶:
    在冰上解凍PARP1酶。簡短離心含有酶的管子,使其完全恢復管子中的全部內容。用1倍PARPtrap™測定緩沖液稀釋酶至約0.5 ng/μl。
    注意:PARP1酶對凍結/解凍很敏感。避免多次凍結/解凍。雖然我們不建議這樣做,但如果不一次使用所有試劑孔,請計算所需的PARP1量,只稀釋足夠實驗所需的量,并將剩余的未稀釋PARP1酶分裝并儲存在-80°C。不要再次使用解凍的分裝液或稀釋的酶。
  5. 按照下表向“高FP對照”,“低FP對照”,“測試抑制劑”和“參考”孔中加入反應的每個組分:
  6. 向標記為“空白”的孔中加入12 μl 5倍PARPtrap™測定緩沖液 + 28 μl蒸餾水 + 5 μl稀釋劑(例如DMSO 10%)。
    注意,“空白”包含反應的緩沖成分,但不包含熒光探針或PARP1酶。
    備注:
  • 參考:一個缺乏PARP1的陰性對照,其中所有熒光DNA以自由形式存在,FP最低(與空白不同,空白中沒有熒光探針)。參考用于進行計算。
  • 高FP對照:不添加NAD+的條件,因此所有與熒光DNA結合的PARP1不能發生核糖基化反應,仍與DNA結合,導致FP達到試劑盒允許的最大值。
  • 低FP對照:在存在NAD+的情況下,所有與熒光DNA結合的PARP1都被允許發生核糖基化反應并與DNA解離,導致主要為自由DNA和低FP。這是在沒有抑制劑的情況下對應于最大PARP1核糖基化活性的條件。
  • 測試抑制劑:FP將與抑制活性水平和結果陷阱在熒光核苷酸雙鏈上成正比增加。
  • 稀釋劑溶液:與用于制備測試抑制劑的DMSO濃度相同,但不含抑制劑。
  1. 室溫孵育30-60分鐘。
  2. 向標記為“高FP對照”的孔中加入5 μl蒸餾水。
  3. 向“空白”、“低FP對照”、“測試抑制劑”和“參考”孔中加入5 μl 10倍NAD+,啟動PARP1酶反應。不要向“高FP對照”中加入NAD+。
    這將使最終反應體積達到50 μl。
    室溫孵育板子60分鐘。
  4. 使用能夠在470-480 nm波長范圍內激發和在508-528 nm范圍內檢測發射光的微孔板讀數器讀取樣品的熒光極化值。
    從所有值中減去空白值。

 

References

  1. Murai, J., et al. Molecular Cancer Therapeutics 2014. 13:433-443.
  2. Murai, J., et. al. Cancer Research 2012. 72:5588-5599.
  3. Zandarashvili, L., et al. Science 2020. 368(6486): eaax6367.

 

相關產品:

名稱 貨號 規格
PARPtrap™ Assay Kit for PARP1 80584 96 & 384 rxns
PARPtrap™ Assay Kit for PARP2 78296 96 & 384 rxns
PARPtrap™ Combo Assay Kit for PARP1 and PARP2 78317 384 rxns
Set of PARP inhibitors 78318 8 x 50 μl
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Fluorescent labeled nicked oligonucleotide duplex (12.5 nM) 78297 100 μl
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PARP2 Enzyme 80502 10 μg
PARP3 Enzyme 80503 10 μg
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BPS Bioscience,激酶研究專家,活性酶、激酶活性/抑制劑篩選檢測試劑盒、慢病毒等,產品涉及臨床前藥物開發過程的每個階段,包括磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶(PARP)等熱門指標的蛋白酶及酶活/抑制劑篩選檢測試劑盒。詳情清咨詢艾美捷科技:https://www.amyjet.com/

 

 

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