髓過氧化物酶MPO檢測的臨床意義和方法

 

髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)又稱過氧化物酶,是血紅素輔基的血紅素蛋白酶,是血紅素過氧化物酶超家族成員之一。存在于髓系細胞(主要是中性粒細胞和單核細胞)的嗜苯胺藍顆粒中,是髓細胞的特異性標志,隨著對MPO研究的深入,人們發現MPO基因多態性導致個體對一些疾病易感性的差異,與人類多種疾病的發生、發展密切相關,因此越來越受到國內外學者的重視。

 

髓過氧化物酶

 

MPO基因多態性

 

人髓過氧化物酶基因位于染色體17q23?q24,含有12個外顯子和11個內含子,長約14 638 bp,調控其基因表達的是生長因子。MPO的mRNA在早幼粒細胞的表達水平最高,其次是原始粒細胞、幼稚和原始單核細胞;當細胞分化到成熟時期,MPO基因表達水平迅速下降?,F已知MPO基因首先表達的是一條相對分子質量為89×103的前體蛋白(precursor protein),經過翻譯后加工,切割成α和β兩種亞基,再聚合為成熟的MPO分子,加上糖鏈,最后形成有功能的MPO。

 

MPO在基因表達過程中存在的缺陷,造成MPO基因DNA序列發生改變,影響其活力。MPO基因的多態性影響其基因的轉錄和表達,對機體的疾病易感性有一定的影響。Chevrier、unionluck 等發現了外顯子11處和啟動子區域的V53F、A332V、I642L和IVS11? 2A→C4個新的基因多態性位點,它們的作用與功能需要進一步研究。Piedrafita、unionluck 等研究發現與疾病有關的位點有5個:463G/A,R569W,Y173C,M251T和外顯子9的堿基缺失。

 

研究最多的是MPO基因啟動子區第463位核苷酸G/A的突變,該位點位于SP1轉錄因子識別結合的順式作用元件中,內含4個Alu重復序列。G/A的突變導致位于Alu反應元件的SP1轉錄因子結合位點消失,從而使MPO轉錄水平顯著下降。

 

unionluck也有報道發現外顯子10的密碼子569存在C被T替代,使CGG→TGG,導致遺傳性MPO缺陷性疾病。還有研究報道在MPO基因129位點存在G被A取代,使MPO基因的表達水平顯著降低。另外,據有關文獻報道,MPO基因463A等位基因與一些癌癥的風險降低相關。

 

MPO的生物學活性

 

MPO是中性粒細胞的功能標志和激活標志,其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細胞(PMN)的功能和活性狀態。純化的人MPO活性為25~35IU/mg,水溶性好,底物H2O2濃度>0.8mmol時酶受抑制,酶反應最佳pH為4.5~5.5,當pH≥10,或≤2時酶失活。

 

MPO的主要功能是在吞噬細胞內殺滅微生物,利用過氧化氫和氯離子產生次氯酸鹽,并形成具有氧化能力的自由基。構成MPO–H2O2–鹵素系統。

 

unionluck研究發現,MPO不僅能殺滅吞噬于細胞內的微生物,而且可釋放到細胞外,破壞多種靶物質,如腫瘤細胞、血小板、NK細胞、原蟲、毒素等,對機體產生和調節炎癥反應等多方面發揮作用。然而,在特定條件下,MPO催化反應生成過量的氧化劑(HOCl、3–氯化酪氨酸、酪氨?;?、硝基酪氨酸等),超過局部抗氧化劑的防御反應時,就會導致氧化應激和氧化性組織損傷。

 

MPO還參與調節炎癥反應的許多過程,MPO缺陷的中性粒細胞因過量的注入炎癥部位而發生氧化反應,大量的超氧化物和氧化物形成,造成炎癥部位組織細胞損傷。此外還有協和洛克的學者發現MPO能與DNA牢固結合形成復合物,有效保護DNA防止其在氧化過程中受損,從而保證髓系細胞的正常分化成熟及功能。

 

嗜中性粒細胞是粒狀白血細胞,在寄主防衛以及噬菌作用破壞感染性細菌的過程中起著重要作用。教科書上關于嗜中性粒細胞功能的模型是這樣的:將毒性過氧化物釋放進含有被攝取的微生物的小囊中,接下來是由髓過氧化物酶催化的鹵化作用。

 

MPO相關疾病

 

1.MPO與心血管疾病

 

1)MPO與冠狀動脈疾病。冠心病是心血管系統中最常見的疾病,而動脈粥樣硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基礎。AS發病過程中通常出現氧化低密度脂蛋白,進而巨噬細胞吞噬脂質變成泡沫細胞,泡沫細胞的形成在AS的發生機制中起關鍵作用。協和洛克研究發現MPO有促進AS病變形成的作用,MPO通過產生自由基和多種反應性物質,促進斑塊形成和不穩定性增加,加速AS進展,進而引起多種并發癥如急性冠脈綜合征(ACS)。研究發現,MPO缺陷的個體罹患心血管疾病的危險性明顯下降。MPO水平的升高不僅與患冠狀動脈疾病易感性相關,還可以預測早期患心肌梗死的危險性。

 

MPO與心血管疾病

髓過氧化物酶的影響

 

2)MPO與急性冠脈綜合征(ACS)。MPO促進ACS病變形成,并影響粥樣斑塊的穩定性,通過增大氧化應激而引起ACS。研究表明,MPO是預測ACS患者發生不良心血管事件的一個新的預測因子,特別是在肌鈣蛋白T(TnT)水平較低的患者,MPO能夠識別那些將來發生心血管事件危險性較高的患者。

 

2.MPO與腫瘤

 

1)MPO與肺癌。在肺部受微生物侵襲、職業暴露以及吸煙時,MPO會隨中性粒細胞的聚集釋放到炎癥部位。MPO可代謝激活多種與肺癌有關的環境致癌物,能將前致癌物如多環芳烴類的苯并芘(BaP)轉化成具有高度反應性和致癌性的活性產物二醇環氧化苯并芘(BPDE),BPDE能與DNA形成加合物并導致姐妹染色體互換,從而導致肺癌。

 

2)MPO與白血病白血病是累及造血干細胞的造血系統惡性腫瘤,其病因尚不完全清楚。

 

3.MPO與地方性砷中毒

 

隨著分子生物學領域的不斷發展,發現MPO在砷中毒所致皮膚病變的發生發展中起著重要作用。MPO被研究者認為可能是砷中毒新發現的一種易感標志物,將在慢性砷中毒的早期診斷和危險評估中具有重要的意義,但國內就這方面的研究還沒有涉及到,國外對其深入的影響機制的研究也不是很多,因此還很難在現有的研究基礎上建立起砷中毒易感性與MPO及其多態性的明確關系,還需要進一步的研究證實。

 

4.MPO與其他疾病

 

MPO在現階段的研究也確定了它在疾病早期診斷與危險評估中具有重要的意義。MPO通過不同的途徑可導致某些疾病,同時其基因多態性也會降低機體對某些疾病的易感受性,從而對機體產生保護作用,但其作用機制仍不清楚,隨著分子生物學領域的不斷發展,MPO的作用機制研究將不斷深入,可能會發現其他一些與疾病易感性有關的多態性位點,從而使人們更清楚的認識其相關疾病的發生、發展,以便對這些人群采取有效的預防和治療措施。

 

MPO的臨床意義

 

1.大量文獻數據表明,MPO可作為冠心病的預測因子和急性冠脈綜合征預后判斷指標:MPO升高提示患者存在冠狀動脈炎癥,斑塊不穩定,但血管未完全堵塞,并未引起心肌壞死,所以MPO可早期識別不穩定斑塊,是ACS早期診斷的炎癥標記物之一。

 

2.MPO作為一種新的預測ACS的炎癥標志物,能識別心肌肌鈣蛋白T(cTnT)陰性的ACS患者未來發生不良心血管事件的危險性。

 

3.國外文獻指出,MPO基線水平能獨立預測其未來30天到6個月內突發心臟不良事件(心肌梗死、再梗死、血管重建或死亡)的危險性。

 

4.MPO能識別低水平C反應蛋白(CRP陰性)的ACS預后不良患者。

 

5.預測35歲以上健康人群未來發生心血管疾病的風險。MPO可獨立預測健康人未來患心血管疾病的風險,而不依賴C-反應蛋白和其他炎癥標記物。

 

權威雜志新英格蘭醫學期刊在2003年報道了一項研究,通過檢測604名胸痛患者的MPO濃度水平,能預測30天至6個月內發生心血管事件的概率。如果單獨檢測cTnT,只有54%的患者被預測,而采用檢測MPO預測出的概率提高到84.5%。

 

MPO的檢測方法

 

1.連續監測法

 

在酸性條件下,以四甲基聯苯胺、鄰甲氧基苯酚或3,3′-二甲氧基聯苯胺為底物,測定血液或組織中MPO活性。Bradley等建立一種測定MPO活性的方法:在pH6.0的條件下,以H2O2及3,3′-二甲氧基聯苯胺鹽酸鹽為底物,MPO催化底物生成桔黃色產物,在460nm波長處連續監測,吸光度的增高速率與MPO的活性成正比。1U的PO指在25℃1min內轉化1μmolH2O2所需MPO量。這種方法具有快速、靈敏、成本低等特點,但易受其他過氧化物酶(例如嗜酸性粒細胞過氧化物酶)和某些血紅素蛋白(例如血紅蛋白、肌紅蛋白)的干擾。

 

  1. ?酶聯免疫吸附法(ELISA)

 

利用MPO抗原性制備特異抗體,通過免疫學方法直接測定血液中酶的蛋白質含量。此方法靈敏度高,可達到ng/ml水平;特異性較高,幾乎不受體液中激活劑、抑制劑的影響,也不受過氧化物酶和血紅素蛋白干擾。由于需要制備高效價抗體,成本較高,并且測定時間較長,因此,目前此法多用于科研領域。Chang等采用ELISA方法測定血漿中MPO濃度,建立中國人MPO正常參考值范圍(14.8~77.1ng/ml),未發現MPO在不同性別及年齡組存在統計學差異。

 

  1. ?流式細胞儀測定法

 

測定中性粒細胞胞漿中MPO的含量。將全血加入紅細胞溶解液中,后使用固定液及細胞膜滲透劑處理細胞,最后加入熒光素(例如藻紅蛋白)標記的抗MPO單克隆抗體,利用抗原抗體反應對MPO染色,對特定細胞群體設門進行流式細胞分析,分析出門內MPO陽性細胞比例和平均熒光強度。此方法特異性強、靈敏度高,但是技術程序比較復雜,需使用特殊儀器。

 

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