病毒基因載體是一種常見的分子生物學工具，其基于病毒的機制，可以有效地將目標基因轉運到培養的細胞或完整的生物體中。在當前的研究中，常見的病毒基因載體包括慢病毒載體（Lentivirus Vector，LV）、腺病毒載體（Adenovirus Vector，AdV）以及腺相關病毒載體（Adeno-associated virus Vector）。這些載體都具有獨特的特點和適用范圍，可以根據具體需求選擇最合適的載體來進行基因傳遞研究。
每種病毒基因載體都有獨特的特點，因此它們在應用過程中展示出各自的優勢和劣勢。此外，它們的應用方向也有所不同。接下來，我們將總結并介紹以下三種病毒基因載體的主要應用和區別：
| 慢病毒(LV) | .用于常規細胞的感染,強大的基因傳遞工具。 |
| .永久整合到基因組中,便于穩轉株的構建,持續傳代。 | |
| .可用于轉基因動物和動物模型的構建。 | |
| .基因治療:通過造血干細胞治療遺傳性疾病。例如白血病,地中海貧血等。 | |
| .細胞治療:CAR-T治療癌癥。 | |
| 腺病毒(ADV) | .對原代細胞和懸浮細胞具有較強的感染能力。 |
| .病毒載體的承載量較大,可插入7.5kb左右。 | |
| .不整合到宿主細胞基因組中,具有瞬時表達的特點,相對比較安全。 | |
| .經常用于感染性疾病以及惡性腫瘤的疫苗開發。 | |
| 腺相關病毒(AAV) | .高安全性和低免疫原性,重組AAV不整合基因組,未發現與任何疾病相關,低 免疫原性。 |
| .AAV有多種血清型,能夠特異性感染不同的組織或器官。動物實驗的首選。 | |
| .體積小,滴度高,遠優于腺病毒和慢病毒的擴散性,可穿透血腦屏障,優秀的 神經元和膠質細胞感染工具。 |
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| 基因治療領域常用的病毒載體。 |
| 病毒表達系統 | 腺病毒 (Adenovirus) |
慢病毒 (Lentivirus) |
腺相關病毒 ?(Adeno-As sociate virus) |
| 病毒基因組 | 雙鏈DNA病毒 | RNA病毒 | 單鏈DNA病毒 |
| 復制 | 條件復制 | 不可復制 | 條件復制 |
| 滴度 | 最高可達1012pfu/ml | 最高可達109TU/ml | 最高可達1012-13v.g/ml |
| 感染細胞類型 | 感染分裂和不分裂細胞 | 感染分裂和不分裂細胞 | 感染分裂不旺盛的細胞 |
| 表達豐度 | 高水平表達 | 中到高水平表達 | 高水平表達 |
| 表達時間 | 快 (1-2天) | 慢 (2-4天) | 1-2周 |
| 持續表達時間 | 病毒基因組游離于宿主基因組外,瞬時表達外源基因 | 病毒基因組整臺于宿主基因組,長時間、穩定表達外源基因 | 病毒基因組游離于宿主基因組外, 在分裂旺盛的細胞中可長時間表達 |
| 克隆容量 | 適合表達小于5kb的外源片段 | 適合表達小于4kb的外源片段 | 適合表達小于2.8kb的外源片段 |
| 免疫原性 | 較高免疫原性 | 低免疫原性 | 低免疫原性 |
| 安全性 | 可能會引起一些咳嗽流涕 | 暫無發現致病性, 已被用于CAR-T治療作用于人體 |
暫無發現致病性, 已通過歐盟和FDA許可, 用作基因治療藥物的載體 |
下面看詳細的講解
?一、慢病毒：
慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種，基因組為雙鏈RNA，慢病毒載體是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，其毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。慢病毒能夠將靶基因導入到一些較難轉染的細胞，如原代細胞等，并且將靶基因隨機整合到宿主的基因組中，能夠在細胞系中穩定表達若干代，可以進行穩轉細胞株的篩選。具有感染分裂期與非分裂期細胞的特性。
慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質?？商峁┧械霓D錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染。
慢病毒形態：病毒粒子被來自宿主細胞的磷脂包膜包裹，病毒糖蛋白（gp41和gp120）對病毒進入細胞很重要。病毒基因組進一步受到由p24蛋白形成的衣殼的保護，并且病毒具有兩個額外的結構蛋白p17和p7。所有這些結構蛋白對于病毒復制周期中的基本功能很重要。在病毒中發現的其他成分包括逆轉錄酶，介導病毒RNA基因組轉化為病毒DNA；整合酶，介導前病毒DNA基因組整合到宿主細胞基因組中；以及在病毒成熟過程中負責加工gag和gag-pol多蛋白的病毒蛋白酶。
HIV-1具有約9kb大小的單鏈陽性RNA基因組，具有編碼九種病毒蛋白質的三個主要開放閱讀框。每個病毒顆粒都有兩個相同的基因組RNA正義拷貝，每個拷貝都編碼病毒復制所需的全部信息。最近的研究表明，這兩個拷貝都是成功完成所必需的。病毒基因組的邊緣是長末端重復序列(LTR)，每個序列包含三個區域，即U3、R和U5，它們對于轉錄、逆轉錄和整合至關重要。
慢病毒的優勢：
1. 慢病毒攜帶的基因組可整合到宿主基因組，使宿主細胞長時間穩定表達外源基因；2. 可感染分裂和非分裂細胞；
3. 低免疫原性，直接注射活體組織不易造成免疫反應，適用于動物實驗；
4.可以更換特異性啟動子；
5. 野生型的HIV大小約為9.8 kb，插入片段可長達5-6 kb。
二、腺病毒：
腺病毒基因組及其攜帶的外源基因不會整合入宿主細胞的基因組中，而是游離于宿主基因組外獨立表達，因此可實現目的基因瞬時、高豐度的表達，同時還避免了因整合而引發的潛在的基因突變和隨機效應，安全性和可控性高。
腺病毒（Adenovirus，Ad）是一種球形、無包膜病毒，直徑約70～90nm，衣殼呈20面體立體對稱結構，由252個殼粒組成，其中240個為六鄰體（Hexon），另外12個為五鄰體（Penton），位于衣殼表面的纖維狀刺突是以五鄰體蛋白為基底，由衣殼表面伸出的12根纖毛（Fiber），纖毛頂端形成頭節區（Knob），五鄰體和纖毛的頭節區可與細胞表面的受體結合，在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用。腺病毒的基因組為線性的、非分段的雙鏈DNA（dsDNA），大小約25~45kb，主要包括病毒DNA復制前期的E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4（編碼病毒調節蛋白）和DNA復制后期的L1～L5（編碼病毒結構蛋白）。Ad的復制不依賴于宿主細胞的分裂，且宿主廣泛，可感染分裂和非分裂細胞，具有嗜上皮細胞性，可通過自身纖毛的頭節區與細胞表面的特異性受體結合被內吞進入細胞，然后從內吞體（Endosome）轉移到細胞質和細胞核內，借助細胞的轉錄和翻譯機器啟動病毒的復制組裝。
目前已知的腺病毒有52種，分別命名為Ad1~Ad52，其中Ad5是目前常用于改造成復制缺陷的腺病毒載體（Adenoviral Vector，AdV）的一種，其基因組是一個線性的36kb的dsDNA分子。Ad5缺失了腺病毒早期表達的基因序列E1和E3，其中，E1是腺病毒復制所必須的，因此，E1缺失使Ad不能完成自身復制，只能依靠包裝細胞提供的反式互補方式進行復制擴增；E3編碼的是細胞表面的一種糖蛋白，可對抗宿主的抗病毒防御系統，因此，E3的缺失可減少宿主免疫反應。近年來，腺病毒載體作為一種常用的基因操作工具，已被廣泛用于基礎研究、疫苗載體及基因治療研究領域。
腺病毒的優勢：
1. 是研究原代非增殖細胞基因表達的最佳系統：腺病毒感染細胞后，1-2 天即可表達；
2.?滴度高：腺病毒系統在轉有 E1 基因的 HEK293 細胞中可進行自我復制，可產生滴度為1010?到1011PFU/mL 的病毒;
3.?載體容量大：可容納不超過5kb 的片段;4.?不整合到染色體中，無插入致突變性：腺病毒除卵細胞以外，幾乎在所有已知細胞中都不整合到染色體中，因此避免了因整合而引發的潛在的基因突變和隨機效應。
三、腺相關病毒：
腺相關病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）是一種小型無包膜病毒，屬于細小病毒科，1965年從腺病毒分離株的污染物中首次被發現，外部呈現20面體結構，直徑約26nm，其衣殼蛋白由VP1、VP2和VP3三種蛋白構成。AAV的基因組是一條單鏈線性DNA，約4700bp，包括上下游兩個開放閱讀框（ORF）：Rep和Cap，位于分別由145個核苷酸組成的2個T形反向末端重復序列（ITR）之間。ITR的作用是充當病毒復制起點和包裝信號，Rep基因參與病毒復制和整合，編碼病毒復制蛋白，Cap基因負責編碼病毒三個衣殼蛋白。自然界中存在的天然野生型腺相關病毒，基因組上存在Rep和Cap基因，而實驗用的AAV載體，是在野生腺相關病毒的基礎上經過人工改造的質粒，基因組上沒有Rep和Cap基因，因此也叫重組腺相關病毒（recombinant AAV，rAAV）。在沒有特別指出的時候，簡稱AAV一般指已經改造過的AAV載體。
AVV有許多血清型，目前已從人和猴體內分離出12種AAV血清型，不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結構、序列和組織特異性，因而其識別與結合的細胞表面受體也有很大差別，這也導致不同血清型轉染的組織類型、細胞類型和感染效率各不相同，在應用AAV病毒過程中需要根據不同組織器官選擇相應血清型的AAV病毒。
由于腺相關病毒具有宿主范圍廣、安全性高、免疫原性低、表達穩定和物理性質穩定等優點，已被廣泛地應用于基礎研究和臨床試驗中，并且腺相關病毒載體已成為世界上最常用的基因治療載體之一。
腺相關病毒的優勢：
1、安全性高：迄今從未發現野生型AAV對人體致病，重組AAV是三質粒系統，基因組序列上去除了大部分的野生型AAV基因組元件，只有ITR序列，其他各個基因由獨立的質粒表達，進一步保證了安全性；
2、免疫原性低：AAV2的基因組僅4681個核苷酸，便于用常規的重組DNA技術進行操作，而且進行動物實驗時造成的免疫反應小，AAV感染組織后很少會被免疫系統清除；
3、宿主范圍廣：可以感染廣泛的哺乳動物并且成功應用于人類和非人類蛋白的表達，不僅可轉染分裂細胞，也可轉染非分裂細胞；
4、多種血清型：AAV1~AAV9以及DJ、DJ/8、Rh10等12種血清型，不同血清型的AAV可以靶向不同的細胞和組織；
5、表達穩定、持續時間長：不整合到宿主基因組，可長期穩定表達外源基因，在宿主細胞中形成附加體（episome）存在于細胞核中，體內可持續表達6個月以上；
6、擴散性強：與慢病毒和腺病毒相比，AAV可以穿透血腦屏障，是最適合用來感染神經元和膠質細胞的。
AAV缺點：
1、載體容量?。?/strong>可插入序列比慢病毒要小很多，目前最多只能容納不超過3kb的外源DNA片段；
2、體外實驗表達水平較低：主要是因為rAAV病毒的基因組是單鏈DNA，在體外環境形成雙鏈并轉錄翻譯外源基因的效率非常低?？梢栽隗w外水平感染rAAV病毒的同時感染輔助病毒比如Ad5型腺病毒或者終濃度10~50mM的dingsuan鈉等方法提高細胞實驗的rAAV表達量；
3、表達速度慢：相比較慢病毒和腺病毒而言，rAAV在感染后需要較長的時間來表達外源基因，一般在感染兩周后才表達，因為需要從單鏈DNA變成雙鏈DNA。
