手把手教你怎么進行熒光素酶檢測

對于初次進行熒光素酶檢測實驗的初學者,可能會遇到許多問題。那么,如何開始這個實驗,以及需要注意哪些問題呢?今天,我將為您介紹一些相關內容,希望能給您帶來一些幫助和指導。

  1. 什么是螢光素/螢光素酶檢測?它如何起作用?

在自然界中,當化學能轉化為光能時,就會發生生物發光。螢火蟲,真菌和海洋生物等許多生物都出于多種原因出現生物發光。當螢光素酶催化螢光素的氧化導致發光時,就會發生該過程。反應機理如下圖所示:

 

  1. 螢光素酶檢測的主要用途是什么?

螢光素酶是檢測啟動子強度和活性的好方法。例如,如果您想研究啟動子區域內的轉錄,可以將熒光素酶基因置于啟動子后面。轉錄該基因后,您將根據產生的熒光強度知道自己是否具有強大的啟動子。檢測中產生更強的熒光意味著更多的熒光素酶被轉錄,這意味著您具有更強的啟動子。 您也可能會遇到的另一個問題是,如果要檢測基因表達,何時選擇熒光素酶測定法,何時選擇qPCR。要記住的是:qPCR方法將測量基因的轉錄本。它不會告訴您轉錄的控制。但是,使用螢光素酶可以測量啟動子的和轉錄調控。還要考慮的另一件事是,您想要研究基因調控的深度。您可能會發現,必須同時執行這兩種技術才能了解項目的主要方面。

 

  1. 我需要怎么進行熒光素酶檢測?
領域 研究類型 試劑 儀器 孔板/管
生物光學成像 細胞、活體動物(如:小鼠) 熒光素酶檢測試劑/熒光素酶檢測試劑盒 酶標儀/單管發光儀 微孔板/微量離心管
注:

1.試劑:您可以選擇一個試劑盒來進行實驗,它會包含您需要的所有必要成分;您也可以選擇試劑,再配制或購買其他實驗中的必要成分。如果您購買的是單獨的產品,那么我們建議您考慮質量,尤其是在熒光素方面。純度的差異會產生影響。試劑盒具有相當大的便利性,例如,您不必制作緩沖液,因為試劑盒中已經提供了它。制備螢光素儲液時,無需稱量,因為您的螢光素已經過測量。它還在您的實驗設置中提供了統一性。

2.儀器:首先檢查您的儀器是酶標儀還是單管發光檢測儀,確認您的儀器是否帶有進樣器。同時取人您的儀器在什么波長下工作以及在什么溫度下工作。所有這些都將幫助您進一步規劃實驗。(酶標儀可以讀取孔板中的樣品。通常范圍在96到384孔之間;單管發光檢測儀,將讀取單個微量離心管。)

3.孔板/管:對于這種測定類型,必須使用平底的板(不要使用圓底或者V型底的孔板)。它們是專門為光學檢查和細胞培養應用而設計的。透明的孔板使您可以看到裂解物,但缺點是相鄰的孔中的背景可能會影響您的觀察。白色的孔板可以防止出現這種背景。但是看不到自己的裂解物。底部透明的白板可以解決可見性和背景問題。

  1. 螢光素酶檢測推薦步驟:

首先需要確認您是進行雙重報告基因檢測還是單個報告基因檢測。熒光素酶檢測的建議步驟如下:

a.?選擇熒光素酶報道基因(螢火蟲熒光素酶或海腎熒光素酶等)。如果要進行雙重報告基因檢測,則螢光素酶需要進行不同的光譜檢查。

b.?將報告基因克隆到質粒中。如果您要進行雙重報告基因檢測,則將其他報告基因克隆到單獨的質粒中。

c.?將質粒與實驗細胞共轉染。

d.?經過24至48小時培養后,取出培養基并裂解細胞。

e.?將包含螢光素的緩沖液添加到裂解物中,使用酶標儀進行檢測。

 

上述步驟是建議的一般步驟,實際情況應根據具體的分析類型和實驗設計,對實驗方法進行相應的調整。

 

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