OZ Biosciences新型聚合物轉染試劑——Helix-IN DNA轉染試劑解決方案

在開發了Lipofection(基于脂質體的轉染方法)和Magnetofection(基于磁性納米顆粒的轉染方法)之后,OZ Biosciences設計和合成一種新型專利陽離子羥基化兩親性多嵌段聚合物(Cationic Hydroxylated Amphiphilic Multi-block Polymer,CHAMP),該聚合物具有生物相容性,可切割性,pH響應性和雙功能性。

 

OZ Biosciences基于CHAMP技術創建了一種全新的轉染試劑,這種新型的雙功能共聚物是生物相容的,可電離的和pH敏感的。它由三個部分組成,其組合并引入三個協同概念:“穿過膜屏障”的概念是由于其電荷、pH敏感性和疏水性;“隱形轉染”的想法是由于DNA被保護,掩蓋和支持,一直到核攝??;生物相容性的概念是由于生物可降解和可切割的部分。

 

OZ Biosciences基于CHAMP技術創建了一種全新的轉染試劑

 

基本原理:

這種新型CHAMP技術的特殊性來自于雙功能陽離子生物聚合物由三個部分組成,每個部分具有不同的特性和功能。

(1)聚合物附近的第一部分將DNA結合和縮合到前所未有的水平,并有助于細胞質遞送。

(2)第二部分是pH響應性和可切割的接頭,通過促進內體膜的不穩定來改善細胞傳遞。

(3)具有確定和優化的分子量的第三部分用作DNA屏蔽和核攝取促進劑。

每個部分的分子量和長度(對于每種類型的聚合物是唯一的)是與整體轉染效率相關的重要參數。

 

工作原理:

  1. 保護和血清穩定性

OZ Biosciences的新型CHAMP聚合物Helix-IN的設計使帶正電荷的復合物在溶液中保持穩定,不會隨時間推移而聚集。

對CHAMP聚合物的結構、多胺組成和接枝密度進行微調和優化,以將聚合物放置在溶解度不受時間影響的精確界面處。此外,親水基團被巧妙地布置在聚合物中,以降低與帶負電荷的血清蛋白(白蛋白......)的相互作用,從而更有效地定義基因載體。

聚合物保持完整,DNA被保護免受降解...

這種帶正電荷的雙功能聚合物具有增強的DNA結合性能,可以在一定程度上保護DNA;正的DNA/聚合物電荷比使DNA與聚合物結合,在保護核酸不被血清酶降解方面發揮關鍵作用。OZ Biosciences設計了這種聚合物,即使在50%胎牛血清中37°C孵育24小時也不會觀察到DNA降解。

 

  1. 細胞攝取

陽離子復合物主要通過靜電相互作用與細胞膜結合,并且大多數復合物通過內吞作用途徑(巨胞飲作用、吞噬作用、內吞作用)被細胞攝取。有文獻記載內吞作用的途徑之一是由網格蛋白介導的。

一旦被內吞,復合物被內吞在早期的核內體中,pH從7.4(細胞表面)下降至6.0(核內體腔內)。隨著核內體進入晚期,pH值將降至5。

 

  1. 內體逃逸和DNA釋放

聚合物通過與“質子海綿”效應相關的陽離子聚合物緩沖能力逃避核內體并將其攜帶物釋放到核中。

在酸性介質中充當弱堿的可質子化胺使核內體內的pH不穩定:一旦進入核內體,特異性ATP酶會產生大量質子流入,這些質子被聚合物緩沖。大量和持續的質子流動伴隨著氯離子的被動進入,導致水的積累。因此,囊泡膨脹直到內體破裂,其內容物被遞送到細胞質中。

第一聚合物嵌段起此作用。此外,pH響應性和可切割的疏水部分增加了補充功能。實際上,隱藏在生理pH值下的連接體在酸性pH值下會暴露出來,導致其裂解和疏水區暴露,從而促進內體膜融合/不穩定。

在這個階段,幾個重要的缺陷可能會影響轉染效率:(1)DNA從核內體逃逸的能力是轉染的主要限制之一;(2)通常認為,DNA必須迅速導入細胞核以避免細胞質降解;(3)核內體(也在細胞表面)中存在細胞傳感器,可以識別外源核酸并誘導抑制轉染的保護性反應。

 

  1. 運輸和核內部化

一旦從核內體釋放出來,多聚體必須經由微管或通過核輸入機制迀移到細胞核。通常,大分子DNA(>3000bp)和聚合物幾乎保持不動,因為向細胞質的擴散依賴于尺寸大小,并且許多細胞質核酸酶會降解核酸。由于仍與雙功能聚合物的第三部分結合,較小的帶正電荷的聚合物可以與陰離子微管或馬達蛋白相互作用,或以隱形模式擴散,直到它們發生核攝取。在所有這些過程中,DNA被掩蓋并被保護不被降解。

永生化細胞進入核的最明顯方式是在有絲分裂期間,發生細胞物質的再分布并且核膜被破壞,然而,并非所有細胞都遵循增殖模式。到目前為止,對復合物載體的核導入知之甚少。 一旦DNA到達細胞核,它就會從帶正電荷的聚合物的第二部分釋放出來,分子量和接枝設計的目的是改善轉染。

圖示:細胞內聚合物的運輸。(1)多聚復合物表面過量的多聚陽離子允許附著于細胞表面,(2)并被靶細胞攝取或內化,通常通過內吞作用。(3)一旦進入核內體囊泡,質子-海綿聚合物的較高程度的質子化引起離子的流入,并且pH響應性接頭被切割,釋放第一聚合物部分(藍色)。(4)滲透壓力的增加導致囊泡膨脹和破裂,這是由于連接體疏水區域的暴露。 第三個部分(紅色)保持與核酸結合,從而降低細胞對DNA的感應,并通過直接輸入細胞核(5a)或通過微管運輸(5 b)來輔助其核遞送。(6)一旦進入細胞核,DNA就會被表達。

 

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分類 產品貨號 產品名稱 產品應用 產品描述
HELIX-IN HX10100 HELIX-IN DNA TRANSFECTION REAGENT 100uL 基因表達 用于細胞系和難轉染細胞的廣譜轉染試劑
HX10500 HELIX-IN DNA TRANSFECTION REAGENT 500uL 基因表達 用于細胞系和難轉染細胞的廣譜轉染試劑
HX11000 HELIX-IN DNA TRANSFECTION REAGENT 1mL 基因表達 用于細胞系和難轉染細胞的廣譜轉染試劑

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應用:

主要用途是用于體外和體內應用的DNA轉染。CHAMP技術增加了轉染量:更多的DNA進入細胞,DNA以隱形模式尋址到細胞核,而不會引起細胞的警覺和應激......該試劑是優先粘附的永生化細胞系的理想選擇,如HEK-293,NIH-3 T3,CHO,COS,HeLa,MCF 7,MEF,RPE-1,C2C12....

它非常適合多個DNA的共轉染。在體內,DNA被濃縮并保護成小的多聚物,限制免疫應答,并能夠通過循環系統導航,直到它們被遞送。

 

如何使用HELIX-IN聚合物轉染試劑?

該protocol是一個非常簡單明了的程序,大體流程如下:

根據細胞類型,轉染試劑以1:1至3:1的比例(每μg DNA 1μL至每μg DNA 3μL)直接與DNA混合。孵育30分鐘后,Polyplexes和boost被添加到細胞上。

 

HELIX-IN

這30分鐘的孵育時間是該方案的基石,允許完全壓縮和保護DNA。

在納米顆粒/DNA復合物自組裝過程中,至少等待30分鐘才能使共聚物和DNA形成穩定的超分子納米顆粒。由于共聚物的多部分性質,形成和穩定復合物的時間略長于“簡單”聚合物,“簡單”聚合物形成更快(10-20分鐘)。

 

產品引用文章鑒賞:

  1. Solinger, J.A., Rashid, HO. & Spang, A. FERARI and cargo adaptors coordinate cargo flow through sorting endosomes. Nature Communications13, 4620 (2022).(使用OZ Biosciences的HELIX-IN聚合物轉染試劑
  2. Cadena del Castillo, C.E., Hannich, J.T., Kaech, A. et al. Patched regulates lipid homeostasis by controlling cellular cholesterol levels. Nature Communications12, 4898 (2021). (使用OZ Biosciences的HELIX-IN聚合物轉染試劑
  3. Liu, X., Salokas, K., Weldatsadik, R.G. et al. Combined proximity labeling and affinity purification?mass spectrometry workflow for mapping and visualizing protein interaction networks. Nature Protocols15, 3182–3211 (2020). (使用OZ Biosciences的HELIX-IN聚合物轉染試劑
  4. Liu, X., Salokas, K., Tamene, F. et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications9, 1188 (2018).(使用OZ Biosciences的HELIX-IN聚合物轉染試劑

 

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OZ Biosciences總部位于法國,其成立宗旨是幫助藥物公司研發和生產新型的藥物導入系統。研究方向主要集中在生物活性材料導入活體組織新技術的研發,已經申請了多項國際專利。OZ Biosciences公司的創辦者是分子導入系統的國際權威,在此領域享有極高的聲望。研發目標是建立新一代的核酸、蛋白、多肽和其它生物分子的轉染導入系統,為廣大科研工作者服務。該公司與許多國際知名企業、大學和科研機構有合作往來。

 

OZ Biosciences公司產品極具特色,主打產品是基于納米技術和生物技術的基礎上發展起來的磁轉染試劑,相對常規商業化轉染試劑,其轉染效率更高。自2003年以來,OZ Biosciences為全球科學界和制藥行業開發和生產創新的分子輸送系統,專門用于轉染和轉導工具。OZ Biosciences專注于生物分子的遞送技術,如DNA,RNA和蛋白質,用于體外和體內應用。在分子遞送系統領域建立了強大的地位,在磁轉染、磁生物分解、磁輔助轉導、聚轉染、脂質轉染和3D轉染技術方面擁有多項專利和專有技術。

 

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