流式細胞儀數據采集與分析

摘要

通過上周對流式細胞儀原理的了解，童靴們可以更好的掌握實驗，今天接著干貨分享如何快速對流式細胞儀數據采集與分析，以便更準確的得出結論。

一、數據采集及顯示

將前向散射光檢測器、側向散射光檢測器及熒光檢測器收集的光信號轉換成電壓脈沖后，再通過模數轉換器轉換成為計算機能夠儲存處理的數字信號。流式細胞儀的數據以FSC標準格式存儲，該標準由“分析細胞學協會”制定。根據FSC標準，數據存儲格式應包括三個文件：樣本獲取文件，數據設置文件和數據分析結果。

數據采集存儲完畢后，細胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道，縱軸表示在該通道內收集到的細胞數量（如圖1）。處在同一通道的每一細胞符合該通道的信號值，而且具有相同的信號密度。通道右側信號的熒光強度明顯高于左側，越靠右側熒光亮度越強。雙參數可在二維散點圖中同時顯示，X軸顯示通道1（FL1），Y軸顯示通道2（FL2）。三維圖通過X，Y，Z三個軸分別顯示每個通道的細胞量（如圖1）。

 

圖1 流式數據分析圖

 

二、設門

通過設門的方法可以定義細胞亞群的區域（如圖2）。如，血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據FSC或細胞大小，在FSC，SSC的散點圖中設門，其數據結果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。

 

圖2 全血樣本中淋巴細胞亞群的數據分析圖

 

三、細胞亞群的數據分析

門內細胞亞群的數據結果可在隨后的圖中顯示。我們可以通過單參數直方圖，二維點圖和三維圖來分析結果。單參數直方圖可定位邊界，二維點圖可設置象限標志。如果需要，還可以建立數據統計表以輸出結果。

直方圖可直觀的顯示單個參數的細胞數量。陰性對照用于決定直方圖中單參數的左右邊界（如圖3）。

 

 

圖3 陰性對照峰M1（NORM001）和CD3 FITC陽性峰（NORM002）

 

 

圖4 直方圖統計結果

 

圖4的統計結果表明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內淋巴細胞2891個。其中M1（陰性）細胞為619個，M2（CD3陽性）細胞為2272個。淋巴細胞亞群CD3陽性百分含量的統計結果為，M2：Gated = 2272/2891 = 78.59%

二維散點圖以雙參數顯示結果，每個點表示一個或多個細胞。圖5左圖為陰性對照圖，用于設定陰性對照邊界，將全圖劃分為四個象限，以區分陰性細胞、單陽性細胞及雙陽性細胞。左下象限（Lower left，LL）為雙陰性細胞，左上象限（Upper left，UL）為Y軸陽性細胞（CD19 PE），右下象限（Lower right，LR）為X軸陽性細胞（CD3 FITC），右上象限（Upper right，UR）為雙陽性細胞（CD19+/CD3+）。

 

 

圖5 陰性對照組（NORM001）和CD3 FITC/CD19 PE雙染樣本（NORM002）

 

 

圖6 二維散點圖統計結果

 

如圖6所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839 = 10.43%

除了劃定象限，分析細胞亞群散點圖的另一個方法是劃定區域，也就是設門，即在門中在設門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區域（如圖7）；然后統計該區域內指定細胞亞群的百分含量。在圖8中，R4門內為CD4+，CD3-的淋巴細胞亞群，其結果為：40/2866 = 1.40%

 

圖7 CD3 FITC/CD4 PE雙染樣本分析圖

 

 

圖8 CD3 FITC/CD4 PE雙染樣本數據統計結果

 

這種門內設門的方法在分析不同的供體細胞時存在一個缺陷，因為如果事先定義好細胞亞群的區域或邊界，在隨后的文件中，下一個樣本的細胞亞群位置會發生變化，這就需要操作者重新調整區域或邊界位置。為避免這種情況的發生，可以采用一種稱為集群分析（cluster analysis）的新方法。該方法的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動，自動變換區域或邊界到相應的細胞亞群位置（如圖9）。

 

 

圖9 使用Attractors分析軟件時二維點圖的前后變化比較

 

四、流式細胞儀的其他數據分析

上面提到的這些分析方法通常適用于計算離散細胞群的百分含量，對于分析單克隆細胞株分子是否呈陽性并不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群，在大多數情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統計結果遠遠大于陰性對照組，那么我們認為其結果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細胞的表達越高，陽性率越高。如圖10所示，左圖為單細胞群的散射光信號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。

 

 

圖10 單細胞株分析圖

 

除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子（接合子）定量分析。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計算每個細胞的抗體結合位點數。如圖11所示，Y軸上的圓圈代表從標準曲線獲取的信息，用于計算每個細胞的接合點位數。

 

 

圖11 QuantiCALC分析每個細胞的抗體結合位點數

 

此外，可以使用ModFit LTTM軟件進行DNA定量分析。因為DNA峰（G0/G1期，S期和G2，M期）不是離散的，所以一般對曲線以下的面積進行積分，以得到每個細胞亞群的百分含量結果（如圖12）。

 

 

圖12 細胞周期的DNA直方圖