PCR疑難問題粉碎機(一)——終點PCR

 

1.PCR的概念

 

PCR,即聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR),主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環構成:即模板DNA先經高溫變性為單鏈,在DNA聚合酶和適宜的溫度下,兩條引物分別與兩條模板DNA鏈上的一段互補序列發生退火,接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)為底物,使退火引物得以延伸,如此反復,使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數擴增。

 

模板DNA

 

2.PCR的分類

 

PCR有很多種,核心就是用引物擴增特定的DNA,以指數方式倍增的DNA達到可以觀察到的量后,通過不同的觀察方法比較DNA相對表達的高低。根據檢測方式的不同,分為終點 PCR(也即常規PCR)和實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time?PCR,qPCR),根據樣本類型的不同,還包括以RNA為模板的反轉錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)。

 

PCR分類

 

終點PCR

 

終點PCR,顧名思義既是對PCR擴增反應的終產物進行定性及定量分析,在反應過程中無法監測反應進行情況,只有反應完成后通過跑膠得到結果。

 

1.熱啟動PCRhot start PCR

 

在傳統的PCR反應中,反應體系各成分(Taq?DNA聚合酶、dNTP 和引物等)均是一次加入并進入循環,在反應溫度由室溫(25℃)上升至高溫(94~95℃)過程中,可能發生引物錯配和二聚體的形成。引物與模板中一些非靶位點的錯配和引物之間形成的二聚體,在Taq酶的作用下均可延伸,這些非特異性產物又可以在后面的PCR循環中繼續擴增,使非特異性產物不斷積累,同時,也消耗反應體系的各成分,最終PCR擴增的特異性產物大大減少。熱啟動PCR(hot start PCR)是指DNA聚合酶只有在樣品溫度至少超過70℃時才發揮作用的PCR。通過這種方式控制PCR反應的必須組分DNA聚合酶,直到反應混合物被加熱到可以阻止非特異引導和引物聚合的溫度后,再啟動PCR達到有效擴增特異性PCR產物的目的。

 

*UNG酶通常和熱啟Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染體系的熱啟動PCR反應系統。

 

UNG酶(Uracil-N-glycosylase,尿嘧啶-N-糖基化酶)的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵,形成的有缺失堿基的DNA鏈在堿性介質以及高溫下會進一步水解斷裂,從而被消除。UNG酶的最佳活性溫度為50℃,95℃滅活。作用:為保證PCR結果的準確性,要預防非特異性PCR擴增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和Taq 酶熱啟動。PCR反應最常見,最重要的污染物是PCR產物,防污染熱啟動PCR試劑盒以dUTP取代dTTP,所以PCR產物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加50℃的保溫步驟,UNG酶即可將反應體系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解,并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂,消除由于污染DNA產生的擴增,從而保證擴增結果的特異性,準確性。

 

2.高保真PCR

 

Taq酶具有5'-3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性,缺少3'→5'的外切酶活性,但沒有從3'→5'方向外切酶的活性,擴增得到的PCR產物的3'末端附有一個“A”堿基,可直接用于TA克隆,但是由于不具有3'→5'外切酶活性,因而在合成中對某些單核苷酸錯配沒有校正功能。DNA聚合酶的校正能力決定了保真度,會影響DNA序列復制的準確性。Solis Biodyne提供的blend mix同時包含Taq酶和校正酶,使得PCR反應既具有5'→3'方向合成DNA的功能,又具有3'→5'方向外切酶的活性和糾錯功能。

 

3.多重PCR

 

多重PCR是指在同一PCR反應體系里加上二對以上引物,同時擴增出多個核酸片段的 PCR反應。多重PCR不僅意味著節省時間、試劑和樣品,還能夠同時對比多個擴增子。

 

在多重PCR中,因無法僅針對一個引物對或目的片段進行反應優化,而是要考慮到所有引物和靶標,所以可能會出現非特異性擴增和效率降低。因此,為盡量減少由非特異性擴增導致的錯配,應對引物進行精心設計。首先,引物序列應盡可能與其目的序列一一對應,并且所有引物的 Tm相差不應超過5°C。其次,在多重PCR開始前,應利用單個PCR反應驗證每個引物對的特異性和擴增效率。此外,擴增子應具有不同的大小,從而能夠通過凝膠電泳對其進行分離鑒定。

 

多重PCR

 

4.長片段PCR

 

常規PCR反應可以擴增到3~4kb的DNA片段,而超過5kb的DNA片段就已經很難擴增出來了。長片段PCR即是指擴增大于5kb的DNA片段。NCBI推薦的基因克隆供應商GeneCopoeia可提供長片段PCR試劑盒,可擴增18kb人來源gDNA以及30kb λ噬菌體DNA為模板等大片段DNA,同時可擴增高GC%片段,適用范圍廣,實驗過程中僅需添加引物與模板,操作簡便。

 

長片段PCR

 

5.高GC含量PCR

 

在DNA(A、T、C、G)4種堿基中,鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率稱為GC含量。因為G、C之間形成三對氫鍵,解鏈所需能量較高,所以模板很難打開,高GC含量(G+C≥60%)模板擴增中所面臨的主要困難是模板中容易形成穩定的二級結構妨礙DNA聚合酶在模板上的推進,而且模板上可能存在多個非特異性的引物復性位點,導致非特異性擴增,甚至很多時候擴增不出靶基因。Solis BioDyne可專業提供專業的高GC含量模板的PCR增強劑和預混液,可適用于GC含量高至79%的模板,輕松解決高GC含量PCR的難題。

高GC含量PCR

 

類型 貨號 名稱
常規PCR 01-01-00500 FIREPol? DNA Polymerase (5 U/ul) ?DNA聚合酶(5 U/ul)
04-12-00115 5*FIREPol? Master Mix Ready to Load with 12.5 mM MgCl2 ?5*PCR預混液,含染料
熱啟動PCR DNA聚合酶 01-02-00500 HOT FIREPol? DNA Polymerase (5 U/μl)?熱啟動DNA聚合酶
高保真PCR 04-25-00115 5xHOT FIREPol? Blend Master Mix Ready to Load with 12.5 mM MgCl2?5*高保真酶PCR預混液,含染料
多重PCR 04-36-00120 5xHOT FIREPol? MultiPlex Mix Ready To Load with 10 mM MgCl2?5*多重PCR預混液,含染料
高GC含量PCR 04-33-00115 5xHOT FIREPol GC Master Mix?5*高GC含量模板PCR預混液
快速PCR 24-02-00001 SolisFAST™ Master Mix Ready To Load 快速PCR預混液,含染料
24-22-00001 SolisFAST™ Master Mix with UNG Ready To Load 快速PCR預混液,含UNG酶,含染料
長片段PCR PC002 長片段PCR試劑盒(18kb gDNA/30kb λDNA)
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