Cytoskeleton新品氧化Actin，你值得擁有

前情回顧：Actin甲硫氨酸氧化：動力學調節的下一個層次

前面我們介紹了肌動蛋白氧化的相關研究進展，這個領域的研究相對來說還比較少還有許多值得探索的空間，細胞骨架研究領域的資深供應商Cytoskeleton開發了幾款新品Actin，致力于給細胞骨架研究者們提供更好的產品，以助力他們進行更深層次的研究，下面我們首先來了解一下相關的背景知識：

芘標記的Actin用于肌動蛋白聚合檢測：

肌動蛋白聚合程度的測定是評價化合物對肌動蛋白功能影響的一種快速有效的方法，到目前為止，最通用、最敏感、最容易使用的方法是Fluorescence enhancement of pyrene conjugates——芘共軛物的熒光增強法來判斷聚合程度，它包括將你的對照品和測試品與少量的芘結合的肌動蛋白混合，然后進行聚合，芘-肌動蛋白單體結合成聚合物形式后，熒光會增強到20倍。

圖2.?芘標記的Actin聚合過程中的熒光增強。通過添加Actin聚合緩沖液（BSA02），芘標記的肌肉肌動蛋白在96孔板中聚合?，1小時內每隔30秒掃描一次熒光信號。聚合的 F-actin與未聚合的芘標記G-actin和對照緩沖液相比熒光增強10倍。

肌動蛋白聚合分為三個階段，成核期（lag phase）、生長期（growth phase）和穩定期（steady state phase），如圖2所示，聚合程度由穩定期的熒光水平來表示。

MICAL（MIC01）是一種細胞內的黃酮蛋白單加氧酶，從昆蟲到哺乳動物都很保守，它在氧化還原（redox）反應中起催化劑的作用。Terman的小組闡明了MICAL與F-actin之間存在相互作用：在使用NADPH作為輔因子情況下，MICAL可氧化肌動蛋白上的Met44和Met47（第44位和47位的甲硫氨酸）位點，Cytoskeleton已經從細菌表達系統生產并純化了人類MICAL1蛋白，重組蛋白被N-末端6xHis標記，由全長蛋白的Redox和CH結構域（aa：1-612）組成，驗證研究表明，MICAL1可以氧化肌動蛋白，從而在蛋白水解測定中將枯草桿菌蛋白酶A的剪切減少90％以上。

MsrB2（MB201）是一種蛋白質，可以還原肌動蛋白上第44位和47位甲硫氨酸（M44和M47），MsrB2在還原肌動蛋白的過程中被氧化，可通過DTT還原再生，當肌動蛋白的M44位點被氧化時，其聚合能力顯著降低；相反，當被氧化的肌動蛋白在M44位點被還原時，其聚合能力會恢復，肌動蛋白聚合試驗可用于檢測MICAL氧化肌動蛋白與MsrB2還原肌動蛋白對Actin聚合的影響。

枯草桿菌素A是一種蛋白酶，已被證明能在M47和G48之間特異性地切割肌動蛋白。當肌動蛋白的M47位點被MICAL氧化時，枯草桿菌蛋白酶A切割的效率顯著降低；反之，當肌動蛋白的M47位點被MsRB2（+DTT）還原時，枯草桿菌蛋白酶A的切割效率顯著提高。因此，枯草桿菌素A可通過評估切割與未切割的肌動蛋白，以確定MsrB2活性及對M47和M44的還原效率。

MICAL-1對Actin聚合的影響分析：

	MICAL-1（MIC01）蛋白純度測定?: ? 通過在4- 20％Tris-甘氨酸凝膠中電泳分離10μg MICAL-1蛋白樣品，并用考馬斯亮藍染色, 使用Precision RedTM蛋白測定試劑進行蛋白定量。
	MICAL-1氧化的肌動蛋白的枯草桿菌蛋白酶A檢測： ? 肌動蛋白（AKL99）對照組 NADPH（400?m?M）+Actin處理組 MICAL（0.076?m?M）+Actin處理組 NADPH+ MICAL +Actin處理組 然后全部用枯草桿菌蛋白酶A(不)處理15min結果： 在NADPH和MICAL共同存在的情況下， 用枯草桿菌蛋白酶A處理后，被切割的肌動蛋白表達量顯著下調，NADPH或MICAL單獨存在時與陰性對照無顯著差異。
	MICAL-1對Actin聚合的影響： 用MICAL（MIC01） + NADPH處理不同濃度的天然肌動蛋白（AKL99），然后將樣品在超速離心機中100,000 g離心1.5 h。 結果：MICAL + NADPH處理后，沉淀（pel,, 主要為actin聚合體）蛋白表達量顯著高于上清液（sup, 主要為actin單體）。 表明Actin濃度為0.1g / ml時，MICAL + NADPH能將肌動蛋白聚合程度降低50%；濃度為0.4m?g / ml時，MICAL + NADPH能將肌動蛋白聚合程度降低約20%。
	MICAL-1對Actin聚合的影響（熒光檢測）?： ? 芘標記的肌動蛋白（AP05）作為對照組 NADPH處理 MICAL（MIC01）處理 NADPH + MICAL（MIC01）處理結果：NADPH + MICAL（MIC01）共同處理，聚合曲線熒光值顯著降低.，表明NADPH + MICAL共同處理才能降低肌動蛋白聚合程度。

MICAL氧化Actin與天然Actin對比分析：?

	MICAL氧化Actin與天然Actin的枯草桿菌蛋白酶處理對比： ? 將芘標記的肌動蛋白（AP05）和MICAL氧化的芘標記肌動蛋白（MXAP95）稀釋至0.1 mg / ml（2.3?mM）。然后用枯草桿菌蛋白酶A（不）處理15min， 結果：與天然肌動蛋白相比，MICAL氧化的肌動蛋白，用枯草桿菌蛋白酶A處理后，被切割的肌動蛋白表達量顯著下調。
?	氧化Actin與天然Actin的肌動蛋白聚合分析對比： ? 不同濃度芘標記的天然肌動蛋白（AP05）和MICAL氧化肌動蛋白與聚合緩沖液一起孵育。 結果： 濃度為0.05g / ml時，MICAL氧化肌動蛋白不會聚合，而天然肌動蛋白則能夠很好地聚合； 濃度為0.1m?g / ml時，MICAL氧化肌動蛋白可聚合至天然肌動蛋白的約50％。 表明MICAL氧化肌動蛋白臨界聚合濃度比未修飾形式更高。

MICAL氧化Actin的MsrB2處理分析：

	MsrB2蛋白純度測定： ? 通過在4-20％tris-甘氨酸凝膠中的電泳分離10μg?MsrB2蛋白樣品，并用考馬斯亮藍染色。使用Precision Red?TM蛋白測定試劑進行蛋白定量。
	MsrB2處理的氧化Actin的枯草桿菌蛋白酶A分析： MICAL氧化的肌動蛋白（MetO肌動蛋白）（Cat＃MXA95）對照組 DTT（10 mM）處理組 MB201（0.3?m?M）處理組 DTT+MB201混合處理組 結果：MsRB2（Mb201）+DTT還原的氧化型肌動蛋白將增強枯草桿菌蛋白酶A切割氧化Actin，而DTT單獨作用不會影響枯草桿菌蛋白酶的切割。
	MsrB2對氧化Actin聚合的影響?： ? 用MsRB2 + DTT處理不同濃度的MICAL氧化的肌動蛋白（MetO肌動蛋白），然后將樣品在超速離心機中100,000 g離心1.5 h。結果：MsRB2 + DTT處理后，沉淀（pel, 主要為actin聚合體）蛋白表達量顯著高于上清液（sup, 主要為actin單體），表明MsRB2 + DTT能還原氧化的Actin，從而增強肌動蛋白的聚合。
	MsrB2對氧化Actin聚合的影響（熒光檢測）?： MsRB2（Mb201）+DTT處理MICAL氧化的芘標記的肌動蛋白（MXAP95）后，熒光信號會在1小時內恢復到與天然芘標記的肌動蛋白相當的水平（AP05），而DTT單獨處理Actin聚合能力不會恢復。

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Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學和細胞過程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發與生產。公司提供藥物篩選、信號轉導、蛋白質轉錄后修飾（PTM）、細胞骨架研究相關的系列試劑盒和產品，尤其以細胞骨架相關研究見長，既能滿足于樣品較少的科學研究，也可以用于小規模篩選研究和高通量大規模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現有產品的藥物篩選服務。

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