Nature Biotechnology:揭示CRISPR-Cas9介導雙鏈斷裂的機制

2024年5月13日,來自德國分子生物學研究所Vassilis Roukos小組在《自然—生物技術》發表了標題為“Linking CRISPR–Cas9 double-strand break profiles to gene editing precision with BreakTag.”的最新研究,利用BreakTag將CRISPR-Cas9雙鏈斷裂圖譜與基因編輯精度關聯起來。

 

據了解,Cas9介導的DNA編輯最初被認為會導致隨機插入和缺失(indel);然而,越來越多的證據表明,Cas9誘導的DNA斷裂的修復不是隨機的,而是強烈依賴于靶位點的序列背景。Cas9能以鈍化和交錯兩種方式裂解DNA,從而產生不同的編輯效果,但在很大程度上Cas9切口類型的決定因素是未知的。

 

在本研究中,研究人員開發了一種基于下一代測序(NGS)的方法,稱為BreakTag,用于分析Cas9誘導的DNA雙鏈斷裂(DSB)并確定Cas9切口的決定因素??傮w而言,在約3500個單導 RNA 靶向的15萬多個內源性靶點和靶外位點,研究檢測了SpCas9介導的裂解情況。研究發現, SpCas9 介導的DSB約35%是交錯的,切口類型受DNA:gRNA互補性和工程Cas9變體的影響。

 

在BreakTag數據上訓練的XGBoost方法的示意圖

在BreakTag數據上訓練的XGBoost方法的示意圖

 

機器學習模型顯示,Cas9的切口取決于原間隔序列,人類基因變異會影響Cas9切口的類型和DSB修復結果。Cas9和工程變體切口與修復結果的匹配數據集表明,Cas9介導的交錯斷裂與精確、模板化和可預測的單核苷酸插入有關,這表明基于裂解的gRNA設計可用于糾正臨床相關致病性單核苷酸缺失。

 

文章來源:

Longo, Gabriel M. C., Sayols, Sergi, Kotini et al, Linking CRISPR–Cas9 double-strand break profiles to gene editing precision with BreakTag.DOI: 10.1038/s41587-024-02238-8.Nature Biotechnology:最新IF:68.164

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