在當前生物技術領域中，CRISPR-Cas9技術已經成為基因編輯的重要工具。本文旨在提供一份詳細的CRISPR-Cas9實驗教程，從gRNA設計到單克隆挑選的全過程指導。通過本文，您將了解到如何設計高效的gRNA序列，掌握CRISPR-Cas9系統的原理與操作步驟，并學會如何進行單克隆篩選，確保實驗結果的準確性和可靠性。無論您是初學者還是有一定經驗的研究人員，本文都將為您提供全面的指導，幫助您成功應用CRISPR-Cas9技術進行基因編輯研究。
基本原理
CRISPR-Cas9是一種細菌天然免疫系統，用于針對外源DNA進行有針對性的降解。它的工作機制是通過CRISPR RNA (crRNA) 和轉錄激活crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA) 之間的互補配對形成復合物，能夠特異性識別基因組中與其互補的序列。這種復合物可以引導Cas9內切酶切割目標DNA片段，導致DNA雙鏈斷裂的形成。這一過程實現了對目標基因組的精確編輯和修飾。如下圖所示：
通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA (single guide RNA)。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行基因操作，在PAM (5’-NGG) 上游 ~3bp進行切割，如下圖所示：
因此本實驗的關鍵步驟是設計一對20bp（不包括NGG在內的）完全互補的oligo插入到如上圖所示的filler。另U6啟動子需要5’端的G起始轉錄，因此若設計的oligo第一個堿基非G，需額外增加一個G。
?詳細操作流程?
1. 設計sgRNA
確定靶基因的序列后，可通過在線網站設計(http://tools.genome-engineering.org )，或根據靶基因的CDS序列自行設計，最方便的是在human KO Library sgRNA里選擇。無論選擇哪種方式，都建議進行一下blast。
附上在線設計網頁截圖。輸入基因的name，填寫email address，設計結果稍后會發送到此郵箱，選擇序列的類型以及物種。如sequence type選擇unique region，一次只能輸入23~500bp的基因片段，最好一次只輸入一個外顯子，避免guide序列跨越內含子，都選擇鍵入后點擊提交，關注郵箱或者在線等。
分析中，顯示你所鍵入的基因序列里有36對可選的guide序列。
分析結束，點擊Download as genbank查看結果，此時也會收到郵件。
選擇分數較高的Guide序列，以Guide#1序列為例，2條單鏈oligo的序列如下：oligo1：5’-?caccGCGTTCAAGTACCAGTTCGTG -3’; oligo2：5’-?aaacCACGAACTGGTACTTGAACGc。標粗部分與經BsmBI酶切后的載體互補配對。BsmBI又名BbsI。
※oligoDNA序列的第一個堿基必須是G，如選取的Guide序列的第一個堿基不是G，需自行添加一個額外的G。
2. Oligo退火形成duplex
PCR儀 95℃ 5 min，緩慢降溫至室溫1h，1：200稀釋duplex。
3. 質粒酶切
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4. 膠回收
大片段約11kb 回收；小片段約2kb為切下來的filler，不要。
5. 連接
室溫連接4-6 h。
6. 轉化（Amp+），挑克隆，搖菌，抽提質粒，測序！
7. 轉染
24孔板，細胞不要過滿，同實驗室日常轉染操作，可選擇性設置三個平行。同時轉染空載作為陰性對照。每孔500 ng。
8. puromycin篩選
轉染穩定48-72h后加puromycin進行篩選，1~3?g/mL，直至不再有細胞數量穩定，不再有細胞因不耐藥死去。
9. 單細胞分離
由于篇幅原因，有限稀釋法具體細節會在后面的文章單獨講解，請關注科研小助手后續文章。100個細胞鋪在一個大盤或96孔板中。剩余的細胞凍存。
10. 獲得單克隆細胞株
當肉眼可見類似于菌落的細胞團時，將其從大盤或96孔板消化下來轉移至12或24孔板中繼續擴大培養。注意不要污染到其它細胞團，不要選取過密的細胞團。
11. 擴大培養，提取細胞全基因組DNA和細胞總蛋白
12. 測序
Guide序列上游100bp左右和下游200bp左右為上下游設計一對引物，以全基因組為模板，以上述引物進行PCR。PCR產物送測序，或將產物用T7E1進行酶切消化檢測突變。
13. Western
與陰性對照相比，靶基因應完全敲除
