彗星實驗全線產品,帶你來看“彗星雨”!

彗星實驗(Comet assay)也被稱為單細胞凝膠電泳實驗(Single cell gel electrophoresis,SCGE),是一種在單細胞水平上檢測DNA損傷的技術。當各種內源性和外源性 DNA 損傷因子誘發細胞 DNA 鏈斷裂時,其超螺旋結構受到破壞,在細胞裂解液作用下,細胞膜、核膜等膜結構受到破壞,細胞內的蛋白質、RNA 以及其他成分均擴散到電解液中,而核DNA由于分子量太大不能進入凝膠而留在原位。電泳過程中,如果DNA沒有損傷,則將停留在原位,染色后呈圓形的熒光團,無拖尾出現。如果DNA受損,斷裂的碎片進入到凝膠中,在電場的作用下,DNA碎片離開原位向陽極遷移,形成拖尾。DNA受損越嚴重,斷裂越多,產生的碎片就越多、越小,則向陽極遷移的DNA碎片量就越多,遷移距離也越長,熒光染色后就能看見“彗星”樣尾長并且熒光強度增強。

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彗星實驗

 

目前有兩種常見的彗星實驗檢測方式——堿性處理&中性處理。在堿性處理條件下,DNA發生變性,因而可檢測包括單鏈及雙鏈斷裂在內的所有DNA 損傷;在中性處理條件下,DNA?維持雙鏈構象,因而僅可以檢測雙鏈斷裂。

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實驗大體流程如下:

 

  1. 制備單細胞懸浮液,在?37℃ 條件下,懸浮液與低熔點瓊脂糖(LM瓊脂糖)混合;
  2. 將瓊脂糖、細胞混合物涂布在預處理的載玻片上;
  3. 4℃條件下用裂解液處理30-60min或過夜,裂解液由去垢劑及高鹽溶液組成,可去除多余的細胞膜及組蛋白;
  4. 將載玻片浸入電泳溶液中;
  5. 進行凝膠電泳,隨后,中和載玻片,待LM瓊脂糖完全干燥后,用熒光染料染色,并于熒光顯微鏡下觀察DNA損傷程度。

 

注:最常用的熒光染料是SYBR?Gold,但熒光染料的觀察需要熒光顯微鏡。如果選擇銀染,使用標準的光學顯微鏡觀察即可。

 

圖片處理

 

在拍照時以tif格式保存圖片,然后用CASP彗星分析軟件分析,如下圖是軟件打開的界面?

 

CASP

 

接下來?導入圖片,用白色畫框選中要分析的區域。下圖中的“調整”項可以調整畫框的位置以包含整個細胞,開始分析前要點擊“開始”,然后點“分析”,再點“保存”,這樣一張圖的數據就分析完了,數據會保存在系統里。點擊“翻頁”可以繼續分析下一張圖。

 

彗星實驗檢測

 

分析完所有圖片后導出數據到Excel表格,保留TailDNA%(尾部DNA百分含量),TailLength(尾長),TailMoment(尾矩)三列數據。根據細胞尾部的DNA百分含量(即TailDNA%),將采集的細胞圖像分為5級:彗星尾部熒光強度(TailDNA%)占總強度為0-6%是0級;6.1%-17.0%是1級;17.1%-35.0%是2級;35.1%-60.0%是3級;60.1%-100.0%是4級。

 

彗星實驗檢測

 

彗星率等于彗星細胞數目(除去0級細胞)占總細胞數目的百分比。任意值等于各等級細胞的百分比與其對應的級別號的乘積之和,它可以綜合反映細胞的DNA損傷情況。最后,綜合分析Tail DNA%、Tail length、Tail moment、彗星率和任意值,共5個指標比較細胞的DNA損傷程度。

 

作為一家專注于開發細胞凋亡、DNA損傷和修復、腫瘤細胞功能與行為等相關研究產品的美國生物技術公司,可為您提供彗星實驗全線產品:

 

彗星分析試劑盒

貨號 名稱 規格
D-AKE3040-15T 彗星法DNA損傷分析試劑盒(3孔載玻片) 15T

 

Biogradetech全球生命科學和醫藥研發行業關鍵原料與試劑的領先供應商:Biogradetech成立于2015年,總部位于美國加利福尼亞州,早期以產品技術研發服務起家,逐步發展了廣泛的產品線,并將其商業化銷售,包括蛋白質、抗體、酶、培養基、試劑盒和儀器。適用于細胞生物學、蛋白質組學、分子生物學、免疫學、微生物學、診斷學、生物化學、神經科學、血液分析和高通量藥物篩選等領域。

 

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