比色法的原理和發展歷程

比色法(colorimetry)是生化檢測中很常用的方法,以生成有色化合物的顯色反應為基礎,通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量。早在公元初古希臘人就曾用五倍子溶液測定醋中的鐵。1795年,俄國人也用五倍子的酒精溶液測定礦泉水中的鐵。但是,比色法作為一種定量分析的方法,大約開始于19世紀30~40年代。

 

 

比色法的原理

 

比色法的理論依據是物質的顏色與光的關系,光是一種電磁波,自然是由不同波長(400~700nm)的電磁波按一定比例組成的}昆合光,通過棱鏡可分解成紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等各種顏色相連續的可見光譜。如把兩種光以適當比例混合而產生白光感覺時,則這兩種光的顏色互為補色。當白光通過溶液時,如果溶液對各種波長的光都不吸收,溶液就沒有顏色。如果溶液吸收了其中一部分波長的光,則溶液就呈現透過溶液后剩余部分光的顏色。例如,我們看到KMnO4溶液在白光下呈紫色,就是因為白光透過溶液時,綠色光大部分被吸收,而紫色光透過溶液。同理,CuSO4溶液能吸收黃色光,所以溶液呈藍色。由此可見,有色溶液的顏色是被吸收光顏色的補色。吸收越多,則補色的顏色越深。比較溶液顏色的深度,實質上就是比較溶液對它所吸收光的吸收程度。

朗伯-比爾定律(Beer-Lambert Law),又稱比爾定律、比耳定律、布格-朗伯-比爾定律,是光吸收的基本定律,適用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質,包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子。比爾-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光電比色法的定量基礎。光被吸收的量正比于光程中產生光吸收的分子數目 。

物理意義是當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質時,其吸光度A與吸光物質的濃度c及吸收層厚度b成正比,而透光度T與c、b成反比。

比爾-朗伯定律數學表達式

A=lg(1/T)=Kbc

A為吸光度,T為透射比(透光度),是出射光強度(I)比入射光強度(I0).

K為摩爾吸收系數.它與吸收物質的性質及入射光的波長λ有關.

c為吸光物質的濃度,b為吸收層厚度.【b也常用L替換,含義一致】

 

比色法的分類

常用的比色法有兩種:目視比色法和光電比色法。

 

1.目視比色法

常用的目視比色法是標準系列法,該法采用一組由質料完全相同的玻璃制成的直徑相等、體積相同的比色管,按順序加入不同量的待測組分標準溶液,再分別加入等量的顯色劑及其他輔助試劑,然后稀釋至一定體積,使之成為顏色逐漸遞變的標準色階。再取一定量的待測組分溶液于一支比色管中,用同樣方法顯色,再稀釋至相同體積,將此樣品顯色溶液與標準色階的各比色管進行比較,找出顏色深度最接近于樣品顯色溶液的那支標準比色管,如果樣品溶液的顏色介于兩支相鄰標準比色管顏色之間,則樣品溶液濃度應為兩標準比色管溶液濃度的平均值。標準系列法的主要優點是設備簡單和操作簡便,但眼睛觀察存在主觀誤差,準確度較低。

 

  1. 光電比色法

光電比色法是在光電比色計上測量一系列標準溶液的吸光度,將吸光度對濃度作圖,繪制工作曲線,然后根據待測組分溶液的吸光度在工作曲線上查得其濃度或含量。光電比色計通常由光源(鎢燈)、濾光片、吸收池、接收器(光電池或光電管)、檢流計五部分組成。光路結構上有單光電池式和雙光電池式兩種:單光電池式儀器的測量結果受光源強度變化影響較大,而雙光電池式儀器則避免了這種影響。與目視比色法相比,光電比色法消除了主觀誤差,提高了測量準確度,而且可以通過選擇濾光片和參比溶液來消除干擾,從而提高了選擇性。光電比色計和紫外-可見分光光度計的光路結構非常相似,它們之間所不同的地方在于:①分光光度計采用棱鏡或光柵作色散元件,因而可以得到純度較高的單色光束。而光電比色計采用濾光片,只能得到一定波長范圍的光譜帶(復合光);②紫外-可見分光光度計采用紫外和可見區的光源,即氫燈和鎢燈,而光電比色計只用一種鎢燈光源,因而前者適用于紫外-可見光譜區,而后者只適用于可見光譜區;③紫外-可見分光光度計可以測定待測組分的精細吸收光譜,不僅可用于定量分析,而且可以作有機化合物的定性和結構分析,而光電比色計只能作定量分析。此外,分光光度計一般都采用靈敏度高的光電倍增管作檢測器,而光電比色計一般用光電池或光電管作檢測器。因此,光電比色計無論在測量的準確度、靈敏度和應用范圍上都不如紫外-可見分光光度計。

 

比色法的發展歷程

 

在20世紀30~60年代,是比色分析發展的繁盛時期,它廣泛用于冶金、地質、金屬材料中微量的金屬和部分非金屬元素的測定。隨著光學儀器制造技術的發展,紫外-可見分光光度計應用日益普及,而酶標儀的出現使得比色法得到了更廣泛的應用。酶標儀實際上就是一臺變相光電比色計或分光光度計。目前較常用的比色法是微量比色法,即用96孔板替代比色杯,酶標儀替代分光光度計,操作簡便,結果的準確性,穩定性和可重復性也更好。

比色法是以生成有色化合物的顯色反應為基礎的,一般包括兩個步驟:首先是選擇適當的顯色試劑與待測組分反應,形成有色化合物,然后再比較或測量有色化合物的顏色深度。比色分析對顯色反應的基本要求是:

①反應應具有較高的選擇性,即選用的顯色劑最好只與待測組分反應,而不與其他干擾組分反應或其他組分的干擾很小;

②反應生成的有色化合物有恒定的組分和較高的穩定性;

③反應生成的有色化合物有足夠的靈敏度,摩爾吸光系數一般應在104以上;

④反應生成的有色化合物與顯色劑之間的顏色差別較大,它們的最大吸收濃度之差一般應在60納米以上。選用的顯色劑可以是一種試劑,也可以是兩種不同的試劑。如果待測組分與兩種不同的試劑反應生成一種有色化合物,則稱為三元絡合物顯色反應。這類顯色反應常常具有更高的靈敏度和選擇性,在比色法和紫外-可見分光光度法中應用非常普遍。選擇適當的顯色反應,研究最合適的反應條件和消除干擾的方法是比色分析的關鍵問題。溶液的酸度、顯色劑的用量、溫度、溶劑等對顯色反應都有影響。

 

在以后的文章中,我們會給大家介紹一些常見的顯色試劑,敬請期待!

 

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