Biogradetech Fast T4 DNA Ligase?快速T4 DNA連接酶的使用方法

T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)的主要功能是連接DNA分子的斷裂端。在DNA復制、重組或修復過程中,DNA鏈可能會發生斷裂或切口,T4 DNA連接酶能夠催化DNA分子的5'磷酸基和3'羥基之間的磷酸二酯鍵形成,從而將DNA片段連接起來,類似于生物界的“502”。除了連接DNA分子的斷裂端,T4 DNA連接酶還可以封閉單鏈RNA或DNA/RNA雜交鏈中的切口,因此在修復RNA或DNA/RNA雜交鏈的損傷時也能發揮作用。T4 DNA連接酶是一種重要的酶,在分子生物學研究和基因工程應用中發揮著關鍵的作用,用于連接DNA片段、構建重組DNA分子和修復DNA損傷等。

Biogradetech的T4 DNA連接酶由攜帶T4噬菌體gene 30的大腸桿菌產生。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA、RNA 或者DNA/RNA復合物間可修復單鏈缺刻,并且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段,但對于單鏈核酸無活性,主要用于限制性內切酶酶切產物DNA片段克隆、基因定點突變與 PCR產物克隆、線性DNA自環化與修復雙鏈DNA缺刻。T4 DNA?Ligase需要 ATP 作為輔助因子,在室溫下完成粘性末端連接反應僅需10分鐘。

貨號 C-BSM205-1000U
名稱 Fast T4 DNA Ligase?快速T4 DNA連接酶
組分 T4 DNA Ligase(Fast) (5 U/ul)??200ul
10×T4 DNA Ligase Buffer????1ml
50% PEG??????????????????1ml

 

使用方法

1.DNA 插入片段連接至載體DNA(粘性末端連接)

① 于冰上配制如下反應體系:

試劑 用量
線性化載體 DNA 20~100 ng
插入片段 DNA 3:1~10:1 (片段:載體摩爾比)
10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul
T4 DNA Ligase 1U (0.2 ul)
Nuclease-Free Water To 20 ul

② 充分混勻并瞬離,22℃溫育10 min;

③ 取1~5 ul的連接產物用于50 ul化學感受態細胞的轉化,或者取1~2 ul用于50?ul電轉感受態細胞的轉化。

 

2.DNA插入片段連接至載體DNA(平末端連接)

① 于冰上配制如下反應體系:

試劑 用量
線性化載體 DNA 20~100 ng
插入片段 DNA 3:1~10:1 (片段:載體摩爾比)
10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul
50% PEG 2 ul
T4 DNA Ligase 5U (1?ul)
Nuclease-Free Water To 20 ul

② 充分混勻并瞬離,22℃溫育1 h;

③ 取1~5?ul的連接產物用于50?ul化學感受態細胞的轉化,或者取1~2?ul用于50 ul電轉感受態細胞的轉化。

 

3.線性DNA自環化

① 于冰上配制如下反應體系:

試劑 用量
線性化載體 DNA 10~50 ng
10×T4 DNA Ligase Buffer 5?ul
T4 DNA Ligase 5U (1?ul)
Nuclease-Free Water To 50 ul

② 徹底混勻并瞬離,22℃溫育10 min;

③ 取 1~5?ul的連接產物用于50?ul化學感受態細胞的轉化,或者取1~2?ul用于50 ul電轉感受態細胞的轉化。

 

4.接頭連接

雙鏈寡核苷酸接頭經常被用于在插入片段上產生粘性末端。接頭通 常包含限制酶識別位點,在連接后經酶切處理產生和克隆載體匹配的粘端。有時候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端,此時無需在接頭連接完 成后進行插入片段的進一步處理。

試劑 用量
線性化載體 DNA 100~500 ng
磷酸化接頭 1-2 ug
10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul
50% PEG 2 ul
T4 DNA Ligase 2U (0.4?ul)
Nuclease-Free Water To 20 ul

② 徹底混勻并瞬離,22℃溫育10 min;

③ 在65℃作用10 min或者70℃作用5 min,進行熱失活。

 

Biogradetech生命科學和醫藥研發行業關鍵原料與試劑的供應商:Biogradetech成立于2015年,總部位于美國加利福尼亞州,早期以產品技術研發服務起家,逐步發展了廣泛的產品線,并將其商業化銷售,包括蛋白質、抗體、酶、培養基、試劑盒和儀器。適用于細胞生物學、蛋白質組學、分子生物學、免疫學、微生物學、診斷學、生物化學、神經科學、血液分析和高通量藥物篩選等領域。

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